蘇書(shū)娟， 邢魯奇， 陳登庭， 蔡向前， 孫碩彤

腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，涉及到腫瘤細(xì)胞穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)屏障、血管基底膜及血管壁進(jìn)入宿主微環(huán)境等多個(gè)環(huán)節(jié)。在這個(gè)過(guò)程中有一個(gè)重要而且貫穿始終的因素就是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)和基膜(basement membrane, BM)的降解。IV型膠原(Collagen IV, Col IV)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，構(gòu)成基膜并調(diào)控細(xì)胞粘附，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其與惡性腫瘤的浸潤(rùn)擴(kuò)散有關(guān)[1]。MMP-2、MMP-9可以特異性地降解基膜的主要功能成分Col IV和細(xì)胞外基質(zhì)而與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。我們用免疫組化雙染法分析MMP-2、MMP-9和Col IV在乳腺導(dǎo)管癌的表達(dá)及其相關(guān)性，并探討其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選用河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2008—2010年的乳腺癌蠟塊60例，其中導(dǎo)管內(nèi)癌18例，微浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌12例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌30例。所有患者均為女性，年齡30～81歲，中位年齡48歲。腫瘤直徑≤2 cm 29例，>2 cm 31例。腋下有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽(yáng)性38例，陰性22例。孕激素受體(progesterone receptor,PR)陽(yáng)性35例，陰性25例。上皮鈣黏蛋白(epithelia cadherin，E-cad)陽(yáng)性54例，陰性6例。C-erbB-2陽(yáng)性47例，陰性13例。所有病例術(shù)前均未做過(guò)放療、化療、內(nèi)分泌治療等。另選10例正常乳腺組織作為對(duì)照組。

1.2 試劑 濃縮型鼠抗人MMP-2單克隆抗體、即用型鼠抗人MMP-9單克隆抗體、即用型鼠抗人Collagen IV單克隆抗體、Dou SP免疫組化雙染試劑盒，均購(gòu)于福州邁新生物工程有限公司。

1.3 免疫組化雙染 為了控制MMP-2、MMP-9和Col IV雙染結(jié)果的可靠性，采用福州邁新公司提供的雙染陽(yáng)性片做對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。4 μm切片脫蠟、水化，蒸餾水浸泡(10 min)，胃酶修復(fù)及內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷，血清封閉，滴加MMP-2(工作濃度1∶30)、MMP-9 4℃過(guò)夜16 h，生物素標(biāo)記的二抗(10 min)，鏈霉菌抗生物素-堿性磷酸酶溶液(10 min)，BCIP/NBT顯色。滴加雙染增強(qiáng)液(20 min)，血清封閉，滴加Collagen IV室溫下2 h，生物素標(biāo)記的二抗(10 min)，鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化酶溶液(10 min)，AEC顯色。蘇木素復(fù)染，水性封片劑封片。

1.4 結(jié)果判定 MMP-2和MMP-9定位于胞漿，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)黑色顆?；蛘邚浡宰睾稚旧?BCIP/NBT/堿性磷酸酶顯色系統(tǒng))為陽(yáng)性。采用陽(yáng)性細(xì)胞百分比并結(jié)合顯色強(qiáng)弱進(jìn)行判斷。計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)合顯色強(qiáng)弱分別為：陰性(-)不顯色；弱陽(yáng)性(+)25%；中度陽(yáng)性(++)26%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)>50%。Col IV(AEC/過(guò)氧化酶顯色系統(tǒng))也定位于胞漿，陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿出現(xiàn)彌漫紅色(AEC/過(guò)氧化酶顯色系統(tǒng))，用于標(biāo)記基膜。Col IV陽(yáng)性：腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)間有連續(xù)的紅色染色帶或者腫瘤細(xì)胞基膜染色帶偶有斷裂，但主要形式是連續(xù)的；Col IV陰性：大部分腫瘤細(xì)胞周邊紅色基膜染色帶缺乏或者呈不連續(xù)的碎片狀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺導(dǎo)管癌中MMP-2 、MMP-9和Col IV的表達(dá) MMP-2在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌、微浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的表達(dá)率分別為72.2%、75.0%、76.7%，明顯高于正常乳腺組織(10%)；MMP-9在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌、微浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的表達(dá)率分別為72.2%、83.3%、83.3%，也明顯高于正常乳腺組織(10%)；Col IV在乳腺導(dǎo)管癌和正常乳腺組織中的表達(dá)率分別是38.3%和100.0%。三者在正常組織和癌組織的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 MMP-2、MMP-9和Collagen IV在乳腺正常組織和乳腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)

MMP-2和MMP-9在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和微浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)有明顯的靠邊趨勢(shì)，在同一個(gè)導(dǎo)管中，它們?cè)趯?dǎo)管中央的表達(dá)強(qiáng)度低于導(dǎo)管外周接近基膜處的表達(dá)強(qiáng)度，甚至有的導(dǎo)管內(nèi)癌僅在接近基膜處有MMP-2、MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)。在微浸潤(rùn)導(dǎo)管癌中，MMP-2、MMP-9在剛突破或者將要突破基膜處表達(dá)增強(qiáng)，呈彌漫的巢狀或者團(tuán)狀，如圖1、2所示。另外，有些臨近癌細(xì)胞的間質(zhì)也有MMP-2、MMP-9的少量表達(dá)。

圖1 MMP-2在乳腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)，在導(dǎo)管外突處表達(dá)較強(qiáng)，此處Col IV消失(免疫組化雙染×200)

圖2 MMP-9在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中的表達(dá)，在導(dǎo)管邊緣靠近基膜處表達(dá)較強(qiáng)，周邊的Col IV斷續(xù)存在(免疫組化雙染×400)

2.2 MMP-2、MMP-9的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 MMP-2、MMP-9在不同年齡組、PR、ER、E-cad分組間的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；而在腫瘤直徑>2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及C-erbB-2陽(yáng)性的乳腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 MMP-2、MMP-9的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

續(xù)表

參數(shù)例數(shù)MMP?2(+)(-)χ2PMMP?9(+)(-)χ2P淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有23203 無(wú)3724134．2940．03821225124．4670．035ER 陽(yáng)性382711 陰性221660．0190．8902991840．0300．862PR 陽(yáng)性352510 陰性251960．1560．9222871960．1370．711E?cad 陽(yáng)性543915 陰性6510．0090．9224212510．0001．000C?erbB?2 陽(yáng)性47389 陰性13674．6200．012407764．1660．041

2.3 MMP-2、MMP-9的表達(dá)與Col IV表達(dá)的相關(guān)性分析 Col IV的表達(dá)與MMP-2表達(dá)間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.506,P<0.05)，與MMP-9的表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.501,P<0.05)，即隨著MMP-2、MMP-9表達(dá)的增加，Col IV的表達(dá)降低，見(jiàn)表3。

表3 MMP-2、MMP-9與Collagen IV的相關(guān)性分析

3 討論

乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的多步驟序貫過(guò)程，是眾多因子相互協(xié)調(diào)及共同作用的結(jié)果[2]。腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、基膜的相互作用是浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，由腫瘤細(xì)胞和周?chē)g質(zhì)合成和分泌的MMPs，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜的大部分組分，導(dǎo)致腫瘤的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以利于其進(jìn)一步侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。MMP-2、MMP-9可以通過(guò)降解基膜和細(xì)胞外基質(zhì)并影響組織重塑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和血管形成[3]。

本研究結(jié)果表明，MMP-2、MMP-9在乳腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于乳腺正常組織，而Col IV的表達(dá)在乳腺導(dǎo)管癌組織中遠(yuǎn)低于乳腺正常組織，且Col IV在乳腺癌中的表達(dá)和MMP-2、MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，伴隨了MMP-2、MMP-9的增加和Col IV的不斷降解。以Col IV為骨架的基膜是反映腫瘤早期浸潤(rùn)的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷腫瘤浸潤(rùn)強(qiáng)度和腋窩淋巴結(jié)受累的一個(gè)較早的預(yù)示因子[4]，因此聯(lián)合檢測(cè)MMP-2、MMP-9和Col IV的表達(dá)可能有助于判斷乳腺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移傾向，為其診斷和預(yù)后提供某些可能的依據(jù)。在所有的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中均未見(jiàn)連續(xù)的Col IV的表達(dá)，說(shuō)明Col IV已被浸潤(rùn)癌中分泌的MMPs所降解。另外，MMP-2、MMP-9在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和微浸潤(rùn)導(dǎo)管癌中的表達(dá)，有明顯的靠邊趨勢(shì)，在同一個(gè)導(dǎo)管中，它們?cè)谥醒氲谋磉_(dá)強(qiáng)度低于導(dǎo)管周邊靠近基膜處的表達(dá)強(qiáng)度或者僅在導(dǎo)管接近基膜處和將要突破基膜處有表達(dá)，說(shuō)明這些靠近基膜邊緣的腫瘤細(xì)胞可能已經(jīng)具有一定的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能，能分泌較多的MMP-2、MMP-9等物質(zhì)存在于腫瘤侵襲的前沿，并與基膜發(fā)生相互作用，它們的含量可能作為預(yù)后的指標(biāo)。MMP-2、MMP-9在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的癌細(xì)胞和癌旁的間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，說(shuō)明這些癌旁的間質(zhì)細(xì)胞也具備分泌某些基質(zhì)金屬蛋白酶的能力，并且有可能也是潛在的促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的生化基礎(chǔ)。

Hanemaaijer等[5]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9的活性較纖維腺瘤明顯升高，MMP-2、MMP-9高表達(dá)的乳腺癌侵襲性和轉(zhuǎn)移性較高，并與腫瘤的分化程度和組織學(xué)分級(jí)、TNM分期有關(guān)。我們的研究也發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9在腫瘤直徑>2 cm和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)高于腫瘤直徑≤2 cm和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺導(dǎo)管癌組織，這和Li等[6]報(bào)道的結(jié)果一致。乳腺癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9高表達(dá)者，瘤體大，分化程度低，具有較高的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，表明MMP-2、MMP-9可能在乳腺癌局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，從而提示我們檢測(cè)MMP-2、MMP-9的表達(dá)有助于判斷乳腺癌的惡性程度和侵襲及轉(zhuǎn)移潛能。另外，在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染C-erbB-2基因能增加細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)伴有基膜降解酶分泌的增加，包括MMP-2、MMP-9、CD44和整合素α2β3。本研究也證實(shí)了C-erbB-2的表達(dá)和MMP-2、MMP-9表達(dá)的關(guān)系，即MMP-2、MMP-9在C-erbB-2陽(yáng)性組高表達(dá)，也從另一方面解釋了C-erbB-2陽(yáng)性的乳腺癌高侵襲、高轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，提示我們測(cè)定乳腺癌患者M(jìn)MP-2、MMP-9和C-erbB-2的表達(dá)水平能更好地反映乳腺癌組織的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

因此，我們認(rèn)為在乳腺導(dǎo)管癌的局部侵襲和遠(yuǎn)

處轉(zhuǎn)移過(guò)程中，MMP-2、MMP-9對(duì)Col IV的降解可能起重要作用。研究MMP-2、MMP-9和Col IV的異常表達(dá)可能有助于判斷乳腺癌的惡性程度和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移潛能，為乳腺癌的診斷和評(píng)估預(yù)后提供一些依據(jù)，或可為乳腺癌治療找到新的靶點(diǎn)。

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