石 娟 管英俊 張炳強 孫豐剛 安淑紅

(1.泰山醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山東 泰安 271000；2.濰坊醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山東 濰坊 261042)

神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTDs)是一類發(fā)生率最高、危害最大的先天畸形，可由遺傳因素和各種環(huán)境因素引起，表現(xiàn)為無腦、露腦、腦膨出、脊柱裂等[1]。高溫在自然環(huán)境、勞動環(huán)境和多種疾病中經(jīng)常出現(xiàn)且難以避免，但其分子機制尚不明確。探討高溫致畸分子機制，尋找防治NTD的有效措施己成為當前該領(lǐng)域研究的熱點之一。

Wnt信號通路是一條控制神經(jīng)元遷移、細胞黏附和細胞增殖等調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育的重要信號通路[2]。β-catenin作為把核外信號傳遞到核內(nèi)的信號蛋白，在Wnt信號通路中發(fā)揮重要作用，該蛋白的表達水平直接影響著Wnt信號通路所起到的生物學(xué)效應(yīng)。Zhang等[3]報道，孕鼠攝入過量維甲酸致胚胎神經(jīng)管β-catenin表達下調(diào)而誘發(fā)NTD。β-catenin在高溫致NTD中的作用機制目前尚不清楚。本實驗在高溫致NTDs模型上，通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和Western blot觀察β-catenin在NTDs發(fā)生過程中胎鼠神經(jīng)上皮細胞中的表達變化，探討β-catenin與神經(jīng)管發(fā)育及高溫致畸發(fā)生之間的關(guān)系，以進一步探討NTDs發(fā)生的分子機制，為預(yù)防人類NTDs的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物模型的建立 成年未經(jīng)產(chǎn)雌性金黃地鼠72只，由衛(wèi)生部生物制品研究所提供，體重(100±10) g。鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，常規(guī)飲水，于晚7～9時與雄鼠按1︰1合籠，觀察有交配動作者次日定為孕l(wèi) d(E1 d)。孕鼠隨機分為對照組和實驗組，各36只，均健康成活至實驗結(jié)束。實驗組孕鼠于孕8 d下午3～4時置42℃水浴20 min，對照組置37℃水浴20 min。分別于水浴后16、40、64 h(相當于胚齡第8.5、9.5、10.5 d)將孕鼠處死，剖腹取鼠胚。

1.2免疫組織化學(xué)染色 胚胎4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片，厚5 μm。E8.5 d的鼠胚切片每間隔50～100 μm裱片，E9.5和10.5 d的鼠胚切片每間隔100～200 μm裱片保留，備染。切片常規(guī)脫蠟入水，0. 01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6. 0)微波抗原修復(fù)，冷卻后用0. 01 mol/L PBS沖洗；滴加正常山羊血清，37℃孵育30 min;滴加小鼠抗β-catenin(1︰200,cell signaling)，4℃冰箱過夜，次日用0.01M PBS沖洗后, 滴加生物素標記的二抗(試劑B)，37℃孵育1 h，0.01M PBS沖洗；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素，37℃孵育30 min，0.01 M PBS沖洗；DAB顯色、二甲苯透明、中性樹脂封片、顯微鏡(Leicad-IMIRB)下觀察拍照。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3Western blot 孕鼠胚胎解剖鏡下剝離鼠胚神經(jīng)管后置于凍存管，并儲存于液氮中備用。胚胎神經(jīng)管組織分別按100 mg/ml加入200 μl RIPA裂解液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)中，并在加入蛋白酶抑制劑(PMSF、aprotinin各1 μl)后勻漿。冰上靜置1 h，于4℃13000 r/min離心30 min。提取上清液，Bradford法測蛋白含量，加入2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，每孔加等量蛋白樣品，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(12% )電泳。電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉TBST液室溫震蕩封閉4 h后TBST洗膜，15 min/次×3，加入TBST稀釋的小鼠抗β-catenin (1︰2000)，4℃過夜，次日TBST洗膜，15 min/次×3，加入TBST稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP (1︰5000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，15 min /次×3，加入ECL發(fā)光劑室溫反應(yīng)2 min，暗室用X感光膠片曝光顯影后沖洗膠片。以上步驟完成后,按同樣步驟檢測膜上的β-actin(1︰2000)蛋白量。膠片上的蛋白條帶經(jīng)掃描后用Quantimet570IW(Leica)計算機圖像分析和處理系統(tǒng)對條帶進行半定量光密度分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 β-catenin在各個時間點實驗組和對照組神經(jīng)上皮細胞及周圍間充質(zhì)均有不同程度的陽性著色，靠近管腔面的多定位于胞漿，其它部位的陽性著色多定位于胞核，其中E10.5 d靠近管腔面胞漿無明顯表達。隨胚齡增加對照組表達水平呈現(xiàn)下降的趨勢，實驗組在高溫處理后E8.5和9.5 d，β-catenin表達水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1，圖1)。

2.2Western blot實驗結(jié)果 β-catenin在對照組各個時間點神經(jīng)管持續(xù)表達，隨著胚齡的增長呈現(xiàn)下降趨勢，表達峰值出現(xiàn)在E8.5 d。β-catenin在高溫處理后E8.5和9.5 d的表達水平明顯低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，E10.5 d其表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2，圖2)。

表1 高溫對金黃地鼠胚胎神經(jīng)上皮細胞β-catenin表達的影響

注：*與對照組相比，P<0.05。

表2 高溫對金黃地鼠胚胎神經(jīng)管β-catenin蛋白表達的影響

注：*與對照組相比，P<0.05。

圖1 神經(jīng)管組織β-catenin的表達(×400)實驗組(A1,B1,C1)，對照組(A2,B2,C2)，E8.5(A),E9.5(B),E10.5(C)

圖2 β-catenin在胚胎神經(jīng)管組織中的表達對照組(c)，實驗組(e)

3 討 論

神經(jīng)管形成是胚胎發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)，是諸多細胞行為按一定順序發(fā)生的結(jié)果，包括細胞增殖、分化、遷移、粘著、凋亡等，涉及到一系列基因的開放和表達。在神經(jīng)管形成和分化過程中，某一或某些相關(guān)基因的不表達、過表達或低表達都會引發(fā)神經(jīng)管發(fā)育異常，造成NTD。

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一種重要的細胞黏附分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要的作用。Wnt基因作為進化上高度保守的一個家族，它們在正常胚胎發(fā)育過程中參與了體軸與胚層形成、器官發(fā)生發(fā)育、干細胞分化和細胞命運決定，Wnt基因異常的時空表達或異常激活與神經(jīng)的異常發(fā)育分化有關(guān)。Wnt在細胞內(nèi)的通路發(fā)現(xiàn)至少有4條，其中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路(canonical wnt/β-catenin pathway)的傳導(dǎo)機制最為明確，在NSC的增殖和分化中主要涉及經(jīng)典Wnt途徑的傳導(dǎo)。在未受刺激的細胞中沒有Wnt信號時，新合成的β-catenin與胞漿中APC、AXIN、CK1和GSK3β相互作用、結(jié)合，形成“降解復(fù)合物”降解β-catenin[4]。在Wnt信號或其它細胞外信號刺激下，Wnt與細胞表面受體Friz-zled家族結(jié)合，通過Dishevelled蛋白拮抗β-catenin降解復(fù)合物(GSK3β-Axin-APC)的形成，進而阻斷β-catenin磷酸化、泛素化(ubiquitination)，β-catenin分子在細胞內(nèi)集聚，并與轉(zhuǎn)錄因子Tcf-4/Lef結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物轉(zhuǎn)運入核，啟動下游靶基因如c-myc、cyclinD1的轉(zhuǎn)錄和表達，調(diào)控細胞生長[5]。

Wnt信號通路參與調(diào)節(jié)生物體發(fā)育過程中多種干細胞的增殖與分化[6]。Willert等[7]首次發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin途徑的調(diào)控，將維持干細胞增殖狀態(tài)，阻止其分化。然而另有報道[8]，Wnt信號通過Tcf/β-catenin和Crebbp的相互作用介導(dǎo)神經(jīng)分化而不是增殖。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中，Wnt/β-catenin途徑引導(dǎo)脊髓背側(cè)聯(lián)合神經(jīng)元(Commissural neurons)的軸突在穿過脊髓中線后由D-V(背-腹)方向改為A-P(頭-尾)方向[9]；控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)前體細胞的生長以及細胞增殖與分化的平衡[10]。

在哺乳類神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，作為Wnt信號通路的關(guān)鍵組成成分，β-catenin蛋白表達水平變化會導(dǎo)致中腦、海馬、脊髓等神經(jīng)組織的缺失或異常。Yusuke等[11]研究了Wnt/β-catenin對E11.5鼠的皮層神經(jīng)元發(fā)育的作用，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達的β-catenin不能誘導(dǎo)早期發(fā)育階段的皮層NSC向神經(jīng)元分化，但Wnt能促進早期發(fā)育階段中的NSC自我更新。β-catenin的失活可導(dǎo)致大腦和顱面發(fā)育的明顯障礙以及背腹側(cè)形成的異常[12]。Chen和Walsh[13]通過轉(zhuǎn)基因的方法使胚胎發(fā)育時期(E15,E17.5d)小鼠的神經(jīng)干細胞穩(wěn)定表達β-catenin，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮層面積較對照組明顯增大，腦的表面出現(xiàn)類似高級哺乳動物的腦溝和腦回，且側(cè)腦室周圍區(qū)域有神經(jīng)干細胞的聚集。也有研究者利用兩個條件性的β-catenin突變型等位基因來改變CNS組織中的β-catenin信號，一個剔除β-catenin，另一個過表達有活性的β-catenin，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在剔除β-catenin以后，小鼠大腦和脊髓發(fā)育延緩，神經(jīng)前體細胞群也不能維持，而過表達β-catenin小鼠的大腦和脊髓組織成分則增加，神經(jīng)前體細胞群體增大[10]。Junghans等[14]研究發(fā)現(xiàn)，從皮質(zhì)發(fā)育早期的神經(jīng)前體細胞敲除β-catenin可導(dǎo)致神經(jīng)上皮分層脫離，失去完整性，并出現(xiàn)大量的細胞凋亡。

本實驗結(jié)果顯示，神經(jīng)管發(fā)育過程中Wnt信號分子β-catenin的時空分布呈現(xiàn)規(guī)律性變化。β-catenin在E8.5～10.5 d的正常金黃地鼠神經(jīng)管組織中持續(xù)表達，同時在神經(jīng)管組織周圍間充質(zhì)中也有不同程度的表達，與文獻報道[15]一致，并且在靠近神經(jīng)管腔側(cè)β-catenin主要在胞漿表達，E8.5～9.5 d神經(jīng)管組織中β-catenin表達水平較高，此時正值神經(jīng)管閉合的時期，提示β-catenin在神經(jīng)管發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果還顯示，實驗組和對照組相比，E8.5和9.5 d的β-catenin表達明顯下調(diào)(P<0.05)，提示高溫可能誘發(fā)β-catenin表達下調(diào)，從而抑制了神經(jīng)干細胞的增殖分化，導(dǎo)致神經(jīng)管閉合障礙。高溫使神經(jīng)管β-catenin的表達下降,這可能是高溫致畸中的重要機制之一。

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