劉 勛

(青島大學醫(yī)學院 266003)

下咽癌是耳鼻咽喉科惡性程度較高的惡性腫瘤，國內統(tǒng)計占全身惡性腫瘤的0.15%～0.24%，占頭頸部惡性腫瘤的2%；國外統(tǒng)計數(shù)字顯示其年發(fā)病率為0.8/10萬，占頭頸部腫瘤的5%，占全身腫瘤的0.3%。絕大多數(shù)(95%)的下咽癌為鱗狀細胞癌，有較強的侵襲和轉移能力，其淋巴結轉移率高，就診時約有50%～60%的患者頸部淋巴結腫大，在臨床上下咽癌預后依靠許多因素判斷，其中最為重要的是有無發(fā)生淋巴結轉移，下咽癌的浸潤和轉移是制約進一步提高治愈率的重要原因。為了提高治愈率，幫助臨床醫(yī)生更加準確地判斷預后，以便進行合理的個體化的綜合治療，因此有必要尋找下咽癌的分子生物學指標。中期因子(MK)是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的生長因子，在調控腫瘤血管生成過程中起重要作用，與血管生成密切相關[1]。本研究擬通過免疫組織化學二步法研究MK在下咽部腫瘤中的表達及其與腫瘤各臨床病理因素之間的關系，探討MK成為控制腫瘤生長及轉移的一個新的理想靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選擇泰安市中心醫(yī)院2004年10月～2009年7月手術切除后經(jīng)病理檢查診斷明確為下咽癌的存檔蠟塊。所有患者在術前均未行放療、化療、激素治療或免疫治療。其中男41例、女6例，年齡38～76歲，平均(56.75±9.90)歲。組織學類型：高分化17例、中分化12例、低分化18例，按UICC1997國際TNM分期標準：T1+T2期22例、T3+T4期25例，有淋巴結轉移27例，無淋巴結轉移20例。所有患者均無遠處轉移，對照組為下咽癌切緣組織15例。

1.2方法 采用免疫組化染色SP法,每例蠟塊連續(xù)切4 μm切片2張。1張作蘇木精-伊紅染色供對照觀察,另一張作MK抗體染色。鼠抗人MK多克隆抗體購自武漢博士德公司。染色方法按照SP-9000通用型試劑盒說明書進行。SP法免疫組織染色流程均設對照作為質量控制:以預實驗陽性切片為陽性對照,用0. 01 mol/L pH值為7.4的PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3免疫組化結果判定 MK顯微鏡下觀察:以細胞膜和(或)細胞質中出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒作為陽性判斷標準，否則為陰性。結果以陽性細胞數(shù)所占百分比表示，即光鏡(100×)下隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞數(shù)≤5%為弱陽性，5%～15%為中等陽性，≥15%為強陽性，如無表達為陰性。

1.4統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的比較分析采用χ2之檢驗。

2 結 果

2.1MK在下咽癌與正常癌旁組織粘膜中的表達 47例下咽鱗狀細胞癌中，MK表達陽性者為32例，陽性表達率為68.1%，正常癌旁組織中MK表達陽性為1例，陽性表達率為6.7%，兩組差異具有統(tǒng)計學意義，見表1。癌組織中MK主要表達于癌細胞中的胞漿和胞膜，呈棕黃色，細胞核無染色，染色在癌組織內呈彌漫性分布，見圖1。

表1 MK在下咽癌組織與癌旁組織中的表達

圖1 MK在下咽癌細胞組織中的表達(SP×400)

2.2MK表達與下咽癌臨床病理學參數(shù)的關系 MK在不同病理分化程度的下咽癌患者中的表達無顯著性差異，臨床T1﹢T2期的MK蛋白的表達陽性率為45.5%，T3﹢T4期的MK蛋白的表達陽性率為88%，兩組差異存在顯著性差異，27例有淋巴結轉移的MK陽性表達率為(85.19%)，明顯高于無淋巴結轉移者(45%)，差異有顯著性見表2。

表2 MK表達與下咽癌臨床病理學參數(shù)的關系

3 討 論

1988年，Muramatasu等運用差異雜交的方法從視黃酸誘導的小鼠胚胎腫瘤細胞系HM1細胞cDNA文庫中篩選出一種新的基因，該基因在小鼠妊娠中期廣泛表達，出生后，只在腎臟有表達。因此，人們將這一新基因產(chǎn)物命名為Midkine，是妊娠中期(midgestation)和腎臟(kiney)的縮寫。MK最初被描述為胎兒與新生兒發(fā)育過程中的調節(jié)因子，其表達譜在發(fā)育過程中高度上調，表達高峰出現(xiàn)在胚胎發(fā)生的中期，而成年后僅在腎臟中表達。其他正常組織幾乎測不出mRNA表達，目前MK的4種生物學功能己被證實：(1)促進胚胎腦神經(jīng)元的軸突向外生長；(2)增加主動脈內皮細胞的血漿酶原活性；(3)使NH3T3細胞癌性轉化；(4)在纖維母細胞系中促進血管生長和有絲分裂作用。

有研究表明，MK在調控腫瘤血管生成過程中起重要作用，與血管生成密切相關。Muramaki等[2]實驗發(fā)現(xiàn)轉染MK基因的膀胱癌細胞在裸鼠體內成瘤能力強于對照組，組織病理學證實這種腫瘤生長速度加快與微血管密度增高有關。有實驗發(fā)現(xiàn)，MK除在卵巢癌細胞表達外，在卵巢上皮性癌細胞的間質中血管內皮細胞也呈弱陽性染色，在血管密集處尤其增強，提示MK可能具有刺激內皮細胞增殖，促進腫瘤間質血管形成的作用[3]。MK高度表達于Wilms瘤、腎細胞癌、肺癌、神經(jīng)纖維瘤和胃癌來源的細胞株。后來，一些實驗室綜合研究了MK基因在人類腫瘤中的表達，采用Northern印跡或RT-PCR研究了MK基因在Wilms瘤、神經(jīng)纖維瘤、肝癌及來自肺、結腸、胰腺癌和腎的異種移植腫瘤中的表達譜。研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)標本中，MK轉錄水平明顯高于正常對照組織。在大多數(shù)乳腺癌組織中也發(fā)現(xiàn)有MK表達，但在非腫瘤組織中未見表達。MK在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤如腦膠質瘤中也有表達，且高表達患者預后通常較差。雖然MK陽性表達率報道不一，但幾乎所有人類實體惡性腫瘤均有MK表達。而且免疫組化及原位雜交分析發(fā)現(xiàn)MK轉錄產(chǎn)物主要位于細胞質，而細胞核無陽性染色，且MK強陽性染色的癌細胞多位于浸潤的前緣地帶。羅祥基等[4]應用免疫組織化學染色、Western印跡等方法檢測，在正常肝組織及良性肝病變組織中，MK無表達；而在人肝細胞癌組織中，MK高表達；在癌旁肝硬化組織中，MK微量表達。Ying-Jia Ren等[5]的研究也發(fā)現(xiàn)，MK在食管鱗狀細胞癌中過度表達，且在腫瘤血管形成和侵襲中起重要作用。MK表達情況不一樣，微血管密度值也不一樣，且在腫瘤細胞浸潤前緣MK蛋白的表達較其他部位更明顯，微血管密度也高，血管生成活躍，表明MK蛋白與血管生成部位的一致性，這提示MK可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中血管生成重要的誘導因素。因此，通過阻斷MK的產(chǎn)生或拮抗其功能，可以達到抑制腫瘤血管生成，限制腫瘤生長和轉移的目的。Mashour等[6]的實驗結果表明MK在腫瘤血管內皮細胞表達，而在正常血管內皮細胞不表達。轉染MK基因的膀胱癌細胞在裸鼠體內成瘤能力強于對照組，組織病理學證實這種腫瘤生長速度加快與微血管密度增高有關[7]。MK在腫瘤演進中的變化顯示其在癌變早期發(fā)揮著生物學功能，有可能用于腫瘤預后的判斷。

我們系統(tǒng)地觀察了從下咽癌切緣組織到不同分期的下咽癌組織中MK的表達情況，發(fā)現(xiàn)其表達是不斷增加的，提示其可能參加了下咽癌的惡性轉化過程。有淋巴結轉移的MK陽性率表達高于無淋巴結轉移的，說明MK參與了下咽癌的浸潤和轉移。本組研究還發(fā)現(xiàn)MK的表達與腫瘤的分化程度無關，高分化和中低分化相比差異無顯著性。研究同時還發(fā)現(xiàn)MK表達與腫瘤浸潤深度有關，隨著浸潤深度的增加，表達逐漸增強，說明MK在下咽癌中可促進腫瘤的侵襲。已知腫瘤血管生成是啟動腫瘤細胞轉移的最早步驟之一，我們認為MK促進腫瘤的侵襲可能與MK能促進腫瘤的血管生成有關，因為我們在下咽癌細胞間質中發(fā)現(xiàn)血管內皮細胞和彈力膜有MK的表達，提示MK可能具有促進癌間質血管生成的作用，因而MK有可能是判斷下咽癌預后的一個參考指標。在臨床上我們還可以把MK作為下咽癌治療的分子靶點，通過阻斷或拮抗其功能達到抑制腫瘤血管生成的目的，為下咽癌提供一個新的治療方向。

[1] 陸永良，姚行，戴利成，等.中期因子在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義[J].中華普外科雜志，2003, 18 (1) : 9-10.

[2] Muramaki M, Miyake H, Hara I, et al. Introduction of midkine gene into human bladder cancer cells enhances their malignant phenotype but increases their sensitivity to antiangiogenic therapy[J].Clin Cancer Res, 2003, 9(14):5152-5160.

[3] 原丹丹，李福琴，董春花，等.中期因子在卵巢上皮性腫瘤中的表達及臨床意義[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2006, 40 (6) :464-466.

[4] 羅祥基，殷正豐，康曉燕，等.中期因子轉錄物及其蛋白在肝細胞癌中的定位與表達研究[J].中華普通外科雜志，2002,17:220-222.

[5] Ying-Jia Ren,Qing-Yun Zhang. Expression of midkine and its clinical significance in esophageal squamous cell carcinoma[J].World I Gastroenterol, 2006,12(13) : 2006-2010.

[6] Mashour GA, Ratner N, Khan GA, et al. The angiogenic factor midkine is aberrantly expressed in NF1-deficient Schwann cells and is a mitogen forneurofibroma-derived cells[J].Oncogene, 2001,20(1):97-105.

[7] Muramaki M, Miyake H, Hara I, et al. Introduction of midkine gene into human bladder cancer cells enhances their malignant phenotype but increases theirsensitivity to antiangiogenic therapy[J].Clin Cancer Res, 2003, 9(14):5152-60.