姜梅杰

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,Pa)是一種重要的醫(yī)院感染病原菌，主要感染醫(yī)院內(nèi)免疫力低下患者[1]。一旦感染，臨床治療十分困難。近年來，Pa已成為醫(yī)院感染最常見的病原菌[1]，對亞胺培南耐藥Pa分離率也逐年上升，甚至所謂“泛耐藥”(pandrugresistance)或“全耐藥”臨床分離株也不少見。研究表明，攜帶各種β內(nèi)酰胺酶編碼基因和(或)外膜通道蛋白OprD2基因缺失是導(dǎo)致Pa對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機制[3-5]。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物是臨床治療Pa感染的常見藥物，但在臨床治療中經(jīng)常發(fā)生Pa治療失敗，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)Pa中亞胺培南可誘導(dǎo)頭孢他啶耐藥。本研究收集本地區(qū)2007年1月～2008年1月臨床分離的各類標(biāo)本325株，紙片擴散法檢測可誘導(dǎo)頭孢他啶耐藥的Pa 116株, 其中93株P(guān)a是亞胺培南耐藥頭孢他啶敏感的Pa，用PCR法檢測IMP、VIM、SPM、GIM基因和外膜通道蛋白OprD2基因，CCCP檢測外排泵與亞胺培南和頭孢他啶敏感性之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 菌株 325株P(guān)a來自本地區(qū)2007年1月～2008年1月臨床分離的各類標(biāo)本，其中痰液246株，血液32株，尿液26株，傷口分泌物14株，腹水7株，所有菌株經(jīng)ATB細(xì)菌鑒定儀鑒定。

1.2 主要試劑及儀器 微生物鑒定儀為法國生物梅里公司生產(chǎn)的ATB微生物鑒定儀；PCR擴增儀為美國PERKIN ELMER公司9600型基因擴增儀；美國ABI公司377型凝膠自動分析儀?；驍U增引物、TaqDNA酶、dNTPs均由大連寶生物工程有限公司提供。MH瓊脂和藥敏紙片為Oxoid公司產(chǎn)品，CCCP購自美國Sigma公司。

1.3 藥敏試驗 采用K-B紙片擴散法測定對慶大霉素(GEN)、亞胺培南(IPM)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢他啶(CAZ)、美羅培南(MEM)、氨曲南(ATM)、阿米卡星(AK)、左氧氟沙星(LEV)、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、哌拉西林(PIP)、奈替米星(NET)、妥布霉素(TOB)、環(huán)丙沙星(CIP)等14種抗生素進行藥物敏感性檢測。按照美國實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)2006年版的標(biāo)準(zhǔn)判讀。銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株。

1.4 D試驗方法[6]國內(nèi)介紹解釋操作[7]。菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?使用4 mm厚度的M-H平板, 亞胺培南和頭孢他啶兩種紙片邊緣之間的距離為15 mm,35 ℃孵育24 h判讀結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：亞胺培南抑菌圈直徑≤13 mm為耐藥, 頭孢他啶抑菌圈直徑≥18 mm為敏感。當(dāng)頭孢他啶紙片的抑菌環(huán)在靠近亞胺培南紙片一側(cè)出現(xiàn)平截現(xiàn)象,即頭孢他啶紙片的抑菌環(huán)看似一大寫D時,判為D-試驗陽性或亞胺培南對頭孢他啶具有誘導(dǎo)耐藥性。兩紙片抑菌環(huán)均為圓形,判為D-試驗陰性。

1.5 外排泵抑制試驗 采用瓊脂稀釋法測定亞胺培南耐藥頭孢他啶敏感并且亞胺培南可誘導(dǎo)頭孢他啶耐藥的Pa加入CCCP前后對亞胺培南和頭孢他啶的MIC值。CCCP在瓊脂平皿中的終濃度為5 mg/L[8]。

1.6 含亞胺培南前后頭孢他啶MIC值分析 采用瓊脂稀釋法測定93株亞胺培南耐藥頭孢他啶敏感并且亞胺培南可誘導(dǎo)頭孢他啶耐藥的Pa對頭孢他啶的MIC值。同時制備含有0.5、1、2、4 μg/ml亞胺培南的頭孢他啶梯度濃度(0.125～64μg/ml倍比稀釋)的M-H瓊脂平板,測定細(xì)菌MIC[9]。同時增加了含0.5、1、2、4 μg/ml亞胺培南的頭孢他啶梯度濃度(3 μg/ml和6 μg/ml)的M-H瓊脂平板。

1.7 細(xì)菌DNA模板制備 采用煮沸法，吸取250μl雙蒸水，挑取過夜培養(yǎng)的菌落2～3個，加入雙蒸水中，混均后加熱煮沸15 min以15000 r/min的速度在低溫高速離心機中離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個干凈的無菌微量試管中，即細(xì)菌總DNA溶液，-20 ℃存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 耐藥基因檢測 各種耐藥基因檢測均采用PCR法。相關(guān)引物的名稱、序列和預(yù)期擴增片段大小見表1。各種耐藥基因擴增的循環(huán)參數(shù)均為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min。所得PCR產(chǎn)物用含EB的1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.9 PCR產(chǎn)物測序 PCR純化產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序。結(jié)果用NCBI的BLAST軟件對所得基因序列進行比對分析。

表1 4種金屬酶相關(guān)基因，外膜通道蛋白OprD2基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 抗菌藥物敏感試驗結(jié)果 93株P(guān)a對14種抗菌藥物的敏感性，見表2。

2.2 亞胺培南耐藥率及D-試驗發(fā)生率 325株P(guān)a中, 51.7%(168/325) Pa對亞胺培南耐藥, 35.7%(116/325) 亞胺培南可誘導(dǎo)頭孢他啶耐藥。116株P(guān)a中80.2% (93/116)是亞胺培南耐藥而頭孢他啶敏感的菌株, 19.8% (23/116)是亞胺培南和頭孢他啶敏感的菌株。

2.3 主動外排機制分析 CCCP存在時亞胺培南和頭孢他啶的MIC結(jié)果與CCCP不存在時亞胺培南和頭孢他啶的MIC結(jié)果無明顯變化。

2.4 含亞胺培南前后頭孢他啶MIC檢測結(jié)果 93株亞胺培南耐藥頭孢他啶敏感并且亞胺培南可誘導(dǎo)頭孢他啶耐藥的Pa中, 在含有0.5、1、2、4 μg/ml亞胺培南的頭孢他啶梯度濃度(0.125～64 μg/ml倍比稀釋)的M-H瓊脂平板, 同時增加了含0.5、1、2、4μg/ml亞胺培南的頭孢他啶梯度濃度(3μg/ml和6μg/ml)的M-H瓊脂平板。測定細(xì)菌MIC值比不含亞胺培南時MIC值升高4～12倍亞胺培南誘導(dǎo)頭孢他啶。

2.5 金屬酶基因和外膜通道蛋白OprD2基因檢測結(jié)果 未檢出VIM、GES、IMP和SPM基因。87.1% (81/93)外膜通道蛋白OprD2基因缺失。OprD2基因電泳圖見圖1。

表2 93株P(guān)a對14種抗菌藥物的敏感性

圖1 OprD2基因PCR電泳圖

3 討 論

銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界,是醫(yī)院感染最常見的革蘭陰性桿菌之一,在臨床的抗感染治療過程中,容易對臨床常用的抗生素產(chǎn)生耐藥性,且耐藥機制復(fù)雜。β內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗菌藥物曾經(jīng)是銅綠假單胞菌感染治療的有效藥物，近年來, β內(nèi)酰胺類抗菌藥物包括亞胺培南在內(nèi)的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率逐年上升，致使抗感染治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。自上世紀(jì)90年代以來，國外學(xué)者應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Pa可以獲得TEM、SHV、OXA、PER、CRPE 、DHA、VEB、IMP、VIM、SPM等β內(nèi)酰胺酶基因，所表達(dá)的產(chǎn)物可以水解β-內(nèi)酰胺類和碳青酶烯類藥物，我國以及世界各地均有發(fā)現(xiàn)[10-12]。Pa外膜蛋白中OprD2是亞胺培南進入菌體的特異性通道。本研究顯示，116株(35.7%)Pa亞胺培南可誘導(dǎo)頭孢他啶耐藥，其中80.2% (93/116)是亞胺培南耐藥頭孢他啶敏感, 19.8% (23/116)是亞胺培南和頭孢他啶均敏感。93株P(guān)a中，未檢出IMP、VIM、SPM和GIM基因，87.1% (81/93)外膜通道蛋白OprD2基因缺失，提示本地區(qū)對亞胺培南耐藥的主要原因是外膜通道蛋白OprD2基因缺失。本研究結(jié)果顯示 CCCP存在時亞胺培南和頭孢他啶的MIC值與CCCP不存在時亞胺培南和頭孢他啶的MIC值無明顯變化，提示外排泵CCCP與亞胺培南和頭孢他啶敏感性無關(guān)。由于本地區(qū)對頭孢他啶的耐藥率低，因此臨床醫(yī)師經(jīng)常選用頭孢他啶治療由銅綠假單胞菌引起的感染，但在臨床實際工作中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)Pa和其他細(xì)菌混合感染的病例，這就要求臨床醫(yī)師有時必須同時用二種抗菌藥物抗感染治療。兩種抗菌藥物如有拮抗作用，往往造成可誘導(dǎo)的抗菌藥物抗菌活性降低，引起抗感染治療失敗，給臨床醫(yī)師應(yīng)用抗生素帶來了很大的困難。因此，臨床微生物室人員應(yīng)開展D-試驗,以指導(dǎo)臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確的使用抗菌藥物。

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