李金田, 梁 晶, 田永衍, 劉永琦, 李 娟, 任紅艷, 張 騫, 張 毅
(甘肅中醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州730000)
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病,該病氣流受限不完全可逆并呈進(jìn)行性發(fā)展,同時(shí)因有害顆粒和氣體的吸入而致肺部炎癥[1]。本病屬中醫(yī)學(xué)咳嗽、喘證、哮證、肺脹等范疇[2,3]。COPD 由于其患病人數(shù)多,死亡率高,社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重,已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題,受到世界各國(guó)的重視。目前的西醫(yī)治療雖能有效緩解癥狀和并發(fā)癥,但仍沒(méi)有藥物能夠有效控制COPD肺功能進(jìn)行性下降。中醫(yī)中藥治療COPD則有著十分廣闊的前景,本研究通過(guò)對(duì)COPD模型大鼠肺組織病理切片MASSON染色的觀察,采用放射免疫分析法對(duì)其支氣管肺泡灌洗液(BALF)以及血清中層黏連蛋白(LN)和透明質(zhì)酸(HA)的測(cè)定,以探討芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒對(duì)COPD小氣道重塑的影響。
健康SPF級(jí)Wistar大鼠60只,♀♂各半,體重(200±20)g,由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):SCXK(甘)2004-0006-0000005)。
動(dòng)物室為SPF級(jí),環(huán)境溫度(23±3)℃,相對(duì)濕度30% ~40%,日光燈采光。清潔級(jí)飼料喂養(yǎng),經(jīng)高壓消毒處理,均由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
按體表面積折算率換算成大鼠等效劑量。
治療藥物:芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒(由黃芪、水蛭、黨參、丹參、麥冬、五味子、枳實(shí)等按一定比例組成,由甘肅中醫(yī)學(xué)院藥物制劑教研室提供);對(duì)照藥物:固本咳喘片(臺(tái)州南峰藥業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):070504)。
蘭州牌香煙(焦油量:12 mg,煙氣煙堿量0.8 mg,煙氣一氧化碳量13 mg):甘肅·蘭州卷煙廠(chǎng);脂多糖(LPS),10 mg/支,Sigma公司,生產(chǎn)批號(hào):L-2880;烏拉坦:中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司;LN放免試劑盒:購(gòu)于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):20080825;HA放免試劑盒:購(gòu)于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):20080825。
AE200電子分析天平(梅特勒—托利多儀器上海有限公司);GC-9111型放射免疫γ計(jì)數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);KDC-2044低速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);恒溫水浴箱:上海醫(yī)療器械七廠(chǎng);光學(xué)顯微鏡:德國(guó)。型號(hào):CX31-32L02;石蠟切片機(jī):德國(guó)。型號(hào):RM2135;石蠟包埋機(jī):日本。型號(hào):TEC-VEM-J2;石蠟脫水機(jī):日本。型號(hào):VIP-5JR-J2。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,按隨機(jī)數(shù)字表法分為:空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組、芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒小劑量組、芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒中劑量組、芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒大劑量組。每組10只,雌雄各半。
采用宋一平等[4]的方法并加以改良建立慢性阻塞性肺疾病模型大鼠。①在正常的室溫環(huán)境中,第1、14天將大鼠麻醉后氣管內(nèi)滴入LPS:大鼠逐一稱(chēng)重,按5 mL/kg體重的比例,腹腔注射濃度為20%的烏拉坦溶液,大鼠麻醉后,將其固定于解剖臺(tái)上,且采用頭低位暴露聲門(mén),行氣管插管后,快速注入溶于注射用生理鹽水的濃度為1 mg/mL的LPS 0.2 mL,將大鼠直立,左右旋轉(zhuǎn),使LPS在兩側(cè)肺內(nèi)均勻分布,后置于安靜處,待其自然清醒后置籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。② 第2~28天(滴LPS當(dāng)天不煙熏)給予大鼠每天一次香煙煙熏,每只大鼠一支煙,持續(xù)時(shí)間大約1/2 h。被動(dòng)吸煙方法:將大鼠放入自制的容積為48 L的玻璃染毒箱(箱底兩側(cè)各有直徑3 cm的進(jìn)煙孔,箱蓋中央有一直徑3 cm的通氣孔)內(nèi),香煙點(diǎn)燃后,進(jìn)行大鼠被動(dòng)吸煙染毒。為減少香煙燃燒所產(chǎn)的水蒸氣對(duì)大鼠的影響,在箱底放置適量硅膠干燥劑。
從第15天起,空白對(duì)照組、模型組給予中劑量顆粒輔料溶液3 mL灌胃;陽(yáng)性藥物對(duì)照組給予固本咳喘片溶液3 mL[相當(dāng)于成藥0.324 g/(kg·d)]灌胃治療;芪蛭大劑量組[相當(dāng)于生藥2.16 g/(kg·d)];芪蛭中劑量組[相當(dāng)于生藥1.08 g/(kg·d)];芪蛭小劑量組[相當(dāng)于生藥0.54 g/(kg·d)]均給予芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒溶液3 mL灌胃治療。每日1次,連續(xù)灌胃28 d,所有動(dòng)物均飼養(yǎng)42 d。實(shí)驗(yàn)藥物的劑量換算:在對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃時(shí),治療藥物和對(duì)照藥物用量均按體表面積比率換算法(D2=D1×0.018×5)配制藥液,臨床等效劑量為實(shí)驗(yàn)的中劑量。
濃度為20%烏拉坦溶液,按5 mL/kg體重腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠,經(jīng)股動(dòng)脈采血,離心取血清約為1 mL,處死大鼠,分離肺臟,夾閉右肺,用3 mL生理鹽水灌洗左側(cè)肺臟,反復(fù)2次,回收量約為4 mL,離心,取上清液1 mL,同血清一起置于-20℃冰箱待測(cè)。用放免法檢測(cè)BALF以及血清中LN和HA水平(按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。然后松開(kāi)右肺,夾閉左側(cè)肺臟,摘取右肺下葉,用4%多聚甲醛溶液固定一周,經(jīng)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋,切片,MASSON染色,光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。
肺組織切片經(jīng)MASSON染色后顯示(鏡下觀察):膠原纖維呈現(xiàn)淡藍(lán)色,肌肉、胞漿呈現(xiàn)紅色,胞核呈現(xiàn)藍(lán)黑色??瞻讓?duì)照組:可見(jiàn)中、末支氣管壁有較薄的膠原層,肺泡區(qū)有少量的膠原。模型組:支氣管壁、肺間質(zhì)、肺泡隔呈現(xiàn)膠原纖維明顯增多,支氣管周?chē)z原增生明顯,并向肺間質(zhì)延伸并且沉積。芪蛭小劑量組:中、末支氣管壁、肺泡隔、肺間質(zhì)呈現(xiàn)膠原纖維沉積,但與模型組相比為少,兩組差異不明顯。芪蛭中劑量組:支氣管壁、肺泡隔、肺間質(zhì)呈現(xiàn)膠原纖維沉積,但與模型組相比明顯減少,兩組差異較為顯著。芪蛭大劑量組:支氣管壁、肺泡隔、肺間質(zhì)呈現(xiàn)膠原纖維與模型組相比為最少。陽(yáng)性對(duì)照組:支氣管壁、肺泡隔、肺間質(zhì)呈現(xiàn)膠原纖維較模型組明顯減少。
表1 各組大鼠肺組織MASSON染色膠原平均面積(±s)
表1 各組大鼠肺組織MASSON染色膠原平均面積(±s)
注:與空白對(duì)照組比較,▲▲P<0.01;與 COPD模型組比較,●●P<0.01;與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較,&P<0.05。
組別 例數(shù)/個(gè) 膠原平均面積/×104μm2空白對(duì)照組10 3.58±1.58模型組 8 21.14±6.33▲▲芪蛭小劑量組 8 10.41±3.90●●&芪蛭中劑量組 9 5.11±2.65●●芪蛭大劑量組 9 5.57±3.50●●陽(yáng)性對(duì)照組 9 6.00±3.28●●
結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,模型組肺膠原平均面積顯著升高,P<0.01。與COPD模型組相比,芪蛭小、中、大劑量、陽(yáng)性對(duì)照組肺膠原平均面積顯著下降,P<0.01。與陽(yáng)性對(duì)照組相比,芪蛭小劑量組肺膠原平均面積明顯下降,P<0.05。
表2 各組大鼠BALF中LN、HA的含量(±s)
表2 各組大鼠BALF中LN、HA的含量(±s)
注:與空白對(duì)照組比較,▲▲P<0.01;與COPD模型組比較,●P<0.05,●●P <0.01;與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較,&P <0.05,&&P <0.01。
組別 例數(shù)/個(gè) LN/(μg/L) HA/(μg/L)空白對(duì)照組10 20.54±4.43 26.28±6.61模型組 8 33.86±5.90▲▲ 86.37±15.29▲▲芪蛭小劑量組 8 28.73±7.10 75.50±11.57芪蛭中劑量組 9 24.52±7.53●● 47.60±11.09●●&&芪蛭大劑量組 9 20.84±6.20●●& 38.58±4.52●●&&陽(yáng)性對(duì)照組 9 27.19±4.35● 69.48±16.33●●
結(jié)果顯示,模型組BALF中LN、HA含量與空白對(duì)照組相比顯著升高,P<0.01。芪蛭中、大劑量組BALF中LN、HA含量與模型組相比顯著下降,P<0.01。陽(yáng)性對(duì)照組BALF中LN含量與模型組相比明顯下降,P<0.05。陽(yáng)性對(duì)照組BALF中HA含量與模型組相比顯著下降,P<0.01。芪蛭大劑量組BALF中LN含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比明顯下降,P<0.05。芪蛭中、大劑量組BALF中HA含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著下降,P<0.01。
表3 各組大鼠血清中LN、HA的含量(±s)
表3 各組大鼠血清中LN、HA的含量(±s)
注:與空白對(duì)照組比較,▲▲P<0.01;與COPD模型組比較,●P<0.05,●●P <0.01;與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較,&P <0.05,&&P <0.01。
組別 例數(shù) LN/(μg/L) HA/(μg/L)空白對(duì)照組10 25.76±3.87 293.48±60.89模型組 8 41.06±8.79▲▲ 483.05±64.24▲▲芪蛭小劑量組 8 34.08±5.63● 415.47±93.66&&芪蛭中劑量組 9 31.39±5.71●● 389.57±89.21●&芪蛭大劑量組 9 28.36±6.44●● 320.38±48.29●●陽(yáng)性對(duì)照組 9 34.04±7.71● 312.25±68.18●●
結(jié)果顯示,模型組血清中LN、HA含量與空白對(duì)照組相比顯著升高,P<0.01。芪蛭小劑量組血清中LN含量與模型組相比明顯下降,P<0.05。芪蛭中劑量組血清中LN含量與模型組相比顯著下降,P<0.01,HA含量與模型組相比明顯下降,P<0.05。芪蛭大劑量組血清中LN、HA含量與模型組相比顯著下降,P<0.01。陽(yáng)性對(duì)照組血清中LN含量與模型組相比明顯下降,P<0.05,HA含量與模型組相比顯著下降,P<0.01。芪蛭小劑量組血清中HA含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著升高,P<0.01。芪蛭中劑量組血清中HA含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比明顯升高,P <0.05。
在COPD發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中,導(dǎo)致肺組織內(nèi)部小氣道重塑的原因是多方面的,其中肺內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)主要成分膠原蛋白、蛋白多糖及黏連糖蛋白是支氣管肺組織的炎癥、損傷、修復(fù)、重塑的重要原因,是COPD不斷發(fā)展的病理基礎(chǔ)。
膠原蛋白是ECM的主要成分,肺臟的膠原成分是維持肺臟結(jié)構(gòu)的完整性、間隔性和具有容積功能的基礎(chǔ)。膠原分布于肺結(jié)締組織網(wǎng)的各個(gè)部位。I型和Ⅲ型膠原是肺間質(zhì)的主要纖維成分,因此膠原在肺臟沉積與降解速度之間的平衡狀態(tài),對(duì)于維持肺臟的正常結(jié)構(gòu)與功能具有十分關(guān)鍵性的作用。通過(guò)對(duì)病理觀察,可以明顯看到芪蛭大劑量組膠原減少最為顯著,中劑量組膠原平均面積為最少。
LN是存在于ECM中的一種糖蛋白,且與膠原一同構(gòu)成基底膜骨架,對(duì)ECM的代謝起著極為重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明,LN具有刺激細(xì)胞遷移、黏附、分化和生長(zhǎng)等豐富的生物學(xué)活性,在肺組織纖維化病變進(jìn)展中具有非常重要的作用[5];LN的增多可以使炎性細(xì)胞數(shù)量增多,同時(shí)積聚于基底膜,導(dǎo)致肺組織纖維化[6];LN的增多還提示上皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷、破壞,不斷有新的細(xì)胞生長(zhǎng),增生和修復(fù),導(dǎo)致上皮增厚[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芪蛭大、中劑量組大鼠BALF以及血清中LN含量同模型組相比顯著降低,其中在BALF中芪蛭大劑量組與陽(yáng)性藥物組相比有明顯差異,且作用要優(yōu)于中劑量組和陽(yáng)性組。說(shuō)明大劑量芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒在對(duì)COPD大鼠肺組織LN的代謝、肺臟纖維化和小氣道的重塑方面,發(fā)揮著重要的作用。
HA是ECM中糖胺聚糖的主要成分。已經(jīng)有研究指出 HA與很多肺臟疾患的發(fā)生有關(guān)[5],是COPD敏感的炎癥標(biāo)志物[8],還參與膠原纖維的合成作用,能使靜止的纖維細(xì)胞活化,形成具有合成和分泌膠原蛋白功能的成纖維細(xì)胞。而肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖以及通過(guò)釋放介質(zhì)使肺內(nèi)ECM產(chǎn)生增多,因此,HA在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起決定性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芪蛭中劑量組、大劑量組、陽(yáng)性組大鼠BALF中HA含量比模型組顯著降低;芪蛭中、大劑量組同陽(yáng)性藥物組相比有顯著性差異;其中大劑量組的作用要優(yōu)于中劑量組。這一結(jié)果說(shuō)明大劑量芪蛭皺肺無(wú)糖顆??擅黠@干預(yù)COPD大鼠肺臟HA的代謝,進(jìn)而影響COPD肺組織纖維化和小氣道的重塑。
COPD的病因不外乎外感與內(nèi)傷。肺系病易虛易實(shí),結(jié)合本病的特點(diǎn),可以概括為肺脾腎虛、痰瘀阻肺。肺、脾、腎三臟之虛是COPD反復(fù)發(fā)作的重要內(nèi)因,血瘀貫穿慢性阻塞性肺疾病始終,是其重要的病理改變。芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒,方中黃芪為補(bǔ)肺氣要藥,補(bǔ)氣以助血行;水蛭破血逐瘀,消散肺中瘀血,共為君藥;黨參健脾益肺,既助黃芪補(bǔ)肺氣,又擅補(bǔ)脾氣而培土生金;丹參既補(bǔ)血又活血,使補(bǔ)而不滯,活而不傷,均為臣藥。五味子斂肺滋腎,麥冬以養(yǎng)陰潤(rùn)肺,既收耗散之肺氣,又潤(rùn)虛損之肺陰;枳實(shí)開(kāi)肺脾之氣而消痞脹,化痰飲,俱為佐藥。諸藥合用,標(biāo)本兼治,虛實(shí)共調(diào),有益氣培元,化痰活血,癟皺肺脹之功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,芪蛭皺肺無(wú)糖顆??梢跃徑夥蝺?nèi)細(xì)支氣管、終末細(xì)支氣管管腔及周?chē)z原纖維的浸潤(rùn)和分泌物阻塞,恢復(fù)纖毛黏連、倒伏、脫落,且芪蛭大劑量組大鼠BALF以及血清中HA以及LN含量較模型組明顯降低,芪蛭中劑量組膠原平均面積最小為各組中最小。結(jié)合其病理特點(diǎn),說(shuō)明芪蛭皺肺無(wú)糖顆粒通過(guò)補(bǔ)氣活血通絡(luò)的方法,在COPD進(jìn)行性加重過(guò)程中,對(duì)小氣道重塑具有重要的干預(yù)作用。
[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(8):453.
[2]王會(huì)仍,王效亞,沈崇芳,等.肺氣管與肺功能變化規(guī)律的初步探討[J].中醫(yī)雜志,1983,(2):6.
[3]蘇梅者,方文賢,金辰羲,等.慢性咳喘病中醫(yī)辨證與肺功能關(guān)系的研究[J].中醫(yī)雜志,1990,31(3):174.
[4]宋一平,崔德健,茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及藥物干預(yù)的影響[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào),2001,22(2):99-102.
[5]高 鋒,孔憲濤,王笑利,等.細(xì)胞外間質(zhì)成分與肝病關(guān)系的研究[J].中華內(nèi)科雜志,1994,33(2):109.
[6]許 滸,熊 密,黃慶華.細(xì)菌感染導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的探討[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,1999,22(12):739-742.
[7]黃翠萍,楊和平,張珍祥.參麥注射液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷防護(hù)機(jī)制探討[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2005,28(1):67-68.
[8]郭庭杰.COPD患者肺內(nèi)的透明質(zhì)酸水平增高與肺功能和局部炎癥的相關(guān)性[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè),2006,33(2):92.