郭 彬，謝偉東，凌英蓉，肖永平，曾 斌，(.深圳市中醫(yī)院藥劑科，深圳 58020;2.清華大學(xué)深圳研究生院生命科學(xué)學(xué)部健康科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 58055)

骨質(zhì)疏松是一種老年性常見病、多發(fā)病，全球現(xiàn)患病人數(shù)超過2億人，然而目前仍缺乏有效的藥物。中藥在抗骨質(zhì)疏松發(fā)揮了重要的作用［1］。滋腎降糖丸為臨床應(yīng)用多年的經(jīng)典中藥復(fù)方，主要成分為黃芪、黨參、龜甲、三七、地黃、熟地、五味子、黃精、牛膝、牡蠣、骨碎粉等，主要功效為益氣養(yǎng)陰、滋腎壯骨［2，3］，臨床發(fā)現(xiàn)具有抗骨質(zhì)疏松作用。由于滋腎降糖丸為中藥復(fù)方制劑，缺乏有效的研究方法，物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究不是很清楚。中藥復(fù)方血清藥理學(xué)是一種有效的研究方法［4］。本研究通過該方法，利用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的模型，探討了滋腎降糖丸對(duì)成骨功能的影響及其相關(guān)機(jī)制，從而為臨床相關(guān)用藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

化學(xué)試劑:成骨誘導(dǎo)試劑地塞米松、2-磷酸抗壞血酸、2-磷酸甘油均購自sigma公司。血清及培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。藥物:滋腎降糖丸為深圳市中醫(yī)院藥劑科提供，批號(hào)為:100224。堿性磷酸酶購自南京建成生物工程研究所，批號(hào)為20100106。Trizol實(shí)際購自美國 Invitrogen公司。引物由Invitrogen公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Q-RT-PCR)試劑盒購自TAKARA公司。細(xì)胞:NIH小鼠脛骨分離到的髓基質(zhì)干細(xì)胞。動(dòng)物:NIH小鼠，雄性，6周齡，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)(SCXK(粵)2008-0002)。

1.2 血清樣品制備

選取深圳中醫(yī)院藥劑科制備的滋腎降糖丸，用蒸餾水研磨配制成混懸液，經(jīng)臨床劑量折算后，小鼠服用劑量為1.5 g·kg-1，經(jīng)口給藥，分別收集小鼠在服藥后 0、0.5、1，2 及4 h后的含藥血清，凍存于-20℃冰箱備用。

1.3 成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

取小鼠脛骨骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，培養(yǎng)約3～5代左右，種植于24孔板中，培養(yǎng)基為 DMEM高糖 +10%FBS，具體培養(yǎng)方法按照以前發(fā)表的方法進(jìn)行［5］。將不同時(shí)間段的含藥血清按1%(v/v)添加到MSC培養(yǎng)孔中，同時(shí)添加成骨誘導(dǎo)試劑(10-8M 地塞米松，50 μg·mL-12-磷酸抗壞血酸、10 mM 2-磷酸甘油)，成骨誘導(dǎo)2周左右。每個(gè)樣設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，觀察藥物對(duì)成骨誘導(dǎo)及相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1.4 茜素紅(ARS)染色

成骨誘導(dǎo)2周后，用茜素紅染色觀察成骨現(xiàn)象。MSC用PBS洗2次后，用4%的多聚甲醛固定10 min。隨后用去離子水洗2次，用2%ARS(pH 4.1)染色15 min，用去離子水洗2次，鈣沉積物表現(xiàn)為桔紅色。

1.5 堿性磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)

成骨誘導(dǎo)第 6、9 d，用細(xì)胞裂解液(20 mM Tris-HCl(pH 7.5)，150 mM NaCl，1%Triton X-100)收集樣品。細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，總蛋白用Bradford的方法(Bio-Rad，USA)在酶標(biāo)儀上于595 nm處進(jìn)行測(cè)試，最后結(jié)果用總蛋白進(jìn)行校正。

1.6 Q-RT-PCR

收集成骨誘導(dǎo)第3、6天的樣品，調(diào)查其含藥血清對(duì) BMP2及RunX2這些基因表達(dá)的影響?？?RNA用Trizol試劑提取。用大連寶生物工程有限公司TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa Code:DRR081)試劑進(jìn)行 Q-RT-PCR。檢測(cè)在 7500 Real Time PCR系統(tǒng) (Applied Biosystems，美國)。程序設(shè)置為95℃ × 30sec，接著95℃ ×5 sec，60℃ ×34sec進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)標(biāo)。所有的樣品測(cè)試3次。引物設(shè)計(jì)如下表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差，組間采用單因素方差分析(ANOVA)，之后用 Newman-Keuls比較檢測(cè)其顯著性，P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清對(duì)茜素紅染色的影響

茜素紅可以和成骨過程形成的鈣結(jié)節(jié)染成橘紅色，如未有成骨發(fā)生，則不顯示橘紅色的鈣結(jié)節(jié)，并且成骨能力大小與染色深淺成正比，結(jié)果見圖1。圖1顯示茜素紅染色結(jié)果，與給藥前0 h收集的血清比較，含藥血清染色顏色顯著增強(qiáng)，表明均有促進(jìn)MSC成骨的作用，在時(shí)間點(diǎn)2 h收集的血清促進(jìn)成果的作用最強(qiáng)，但在4 h時(shí)，促成骨作用有所減弱。表明再服用藥物2 h內(nèi)，血液中開始出現(xiàn)了促成骨分化的活性因子。

2.2 含藥血清對(duì)堿性磷酸酶活性的影響

成骨過程中，細(xì)胞中堿性磷酸酶活性將顯著增加，有利于成骨，因此檢測(cè)其活性可以很好反應(yīng)其成骨能力。將0 h血清設(shè)為對(duì)照，對(duì)照組活性設(shè)置為100%，其他時(shí)間點(diǎn)均與0 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，與0 h血清比較，含藥血清在成骨誘導(dǎo)后第6和9天時(shí)均能顯著增加堿性磷酸酶的活性，尤以2 h含藥血清作用最強(qiáng)，4 h時(shí)有所回落，見圖2。此結(jié)果與以上茜素紅染色結(jié)果類似。圖2中0 h，給藥后0 h時(shí)收集的血清;0.5 h，給藥后0.5 h時(shí)收集的血清;1 h，給藥后1 h時(shí)收集的血清;2 h，給藥后2 h時(shí)收集的血清;4 h，給藥后4 h時(shí)收集的血清。數(shù)據(jù)表示為均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，*P＜0.05，**P ＜0.01。

2.3 含藥血清對(duì)BMP2及RunX2表達(dá)的影響

BMP2及RunX2是成骨分化過程的關(guān)鍵因子，其基因早期表達(dá)增高提示將促進(jìn)成骨的發(fā)生。我們選取了在成骨誘導(dǎo)過程中較早的時(shí)間點(diǎn)第3 d和第6 d，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含藥血清顯著促進(jìn)BMP2及RunX2基因的表達(dá)，以2 h作用效果最強(qiáng)，見圖3。這表明含藥血清成骨作用與促進(jìn)這些基因的表達(dá)存在較好的關(guān)聯(lián)。圖3中0 h，給藥后0 h時(shí)收集的血清;0.5 h，給藥后0.5 h時(shí)收集的血清;1 h，給藥后1 h時(shí)收集的血清;2 h，給藥后2 h時(shí)收集的血清;4 h，給藥后4 h時(shí)收集的血清。數(shù)據(jù)表示為均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，*P＜0.05，**P ＜0.01。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清對(duì)小鼠MSC成骨誘導(dǎo)的影響Fig 1 Effects of drug-containing serum sampled at different time points on osteogenesis differentiation of MSC

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清對(duì)成骨誘導(dǎo)第6和9天的MSC堿性磷酸酶活性的影響Fig 2 Effects of drug-containing serum sampled at different time points on the alkaline phosphatase activities at 3 and 6 days of induction of osteogenesis

3 討論

骨質(zhì)疏松的發(fā)病率很高，然而目前仍缺乏有效的藥物。中藥在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松等方面可能起了重要的作用。盡管如此，目前中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究較為困難。血清藥理學(xué)是20世紀(jì)80年代日本學(xué)者田代真一提出的在動(dòng)物給藥后，一定時(shí)間內(nèi)取血清研究藥物藥理活性的一種方法。后來國內(nèi)外很多學(xué)者開始使用這一方法來研究中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。

滋腎降糖丸為深圳市中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的中藥復(fù)方制劑，臨床研究發(fā)現(xiàn)，該藥具有防治骨質(zhì)疏松的作用，然而具體的機(jī)制不是很清楚。本研究首次通過血清藥理學(xué)的方法，在動(dòng)物服用滋腎降糖丸后，血液中可能含有有效成分，我們通過骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨模型，觀察到滋腎降糖丸具有明顯的促成骨分化的作用(茜素紅染色增強(qiáng)及堿性磷酸酶活性增加)。這提示滋腎降糖丸促骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化可能是其抗骨質(zhì)疏松的重要機(jī)制之一。

BMP2及RunX2是成骨分化過程的關(guān)鍵因子，BMP2誘導(dǎo)成骨能力較強(qiáng)，而RunX2則是成骨細(xì)胞分化和骨形成過程中的控制基因，它們?cè)诔晒沁^程中起了重要的作用［6］。通過 RTPCR實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，含藥血清顯著促進(jìn)這些因子的表達(dá)。因此我們推測(cè)滋腎降糖丸通過上調(diào)BMP2及RunX2關(guān)鍵因子的基因表達(dá)，來促進(jìn) MSC的成骨分化，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

該研究為該中藥復(fù)方的臨床應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)，中藥復(fù)方盡管復(fù)雜，但經(jīng)過血清藥理學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)等多種交叉學(xué)科的研究方法，我們發(fā)現(xiàn)滋腎降糖丸可能通過直接作用于MSC，發(fā)揮成骨效應(yīng)，這為該類中藥復(fù)方的機(jī)制研究提供了重要的參考。然而，血清中又是何種成分發(fā)揮這種促成骨的效應(yīng)，我們并不是很清楚，這期待在將來的研究中用血清藥物化學(xué)方法來加以解決。

圖3 Q-RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清對(duì)成骨誘導(dǎo)第3 d和第6 d的MSC兩個(gè)關(guān)鍵因子BMP2及RunX2基因表達(dá)的影響Fig 3 Effects of drug-containing serum sampled at different time points on gene expressions of BMP2 and RunX2 at 3 and 6 days of induction of osteogenesis detected by Q-RT-PCR assay

4 結(jié)論

滋腎降糖丸抗骨質(zhì)疏松的作用可能與上調(diào)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞BMP2及RunX2的表達(dá)，從而促進(jìn)其成骨分化有關(guān)。

［1］ 王 萍，王愛民，彭宣灝.中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松的研究概況［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17(5):859.

［2］ 李惠林，黃皓月，張志玲，等.滋腎降糖丸治療腎虛型2型糖尿病 30例療效觀察［J］.新中醫(yī)，2006，38(2):50.

［3］ 呂 萍，龍新生，王菊萍，等.滋腎降糖丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2004，11(6):362.

［4］ 楊彥芳，王玉芹.中藥復(fù)方血清藥理學(xué)方法規(guī)范化探討［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20(5):380.

［5］ GaoL， CaiG， ShiX. Beta-ecdysterone induces osteogenic differentiation in mouse mesenchymal stem cells and relieves osteoporosis［J］.Biol Pharm Bull，2008，31(12):2245.

［6］ Phimphilai M，Zhao Z，Boules H，et al.BMP signaling is required for RUNX2-dependent induction of the osteoblast phenotype［J］.J Bone Miner Res，2006，21(4):637.