馬 莉 田 宏 張 潔 艾慶燕 苗乃周 王海旭 王麗蓉 邱曙東＊ 張秋養(yǎng)＊

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系,陜西西安710061;2延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室,陜西延安716000)

睪丸內(nèi)精子發(fā)生和附睪內(nèi)精子成熟是一個(gè)高度程序化和組織化的過程,一方面受到生精細(xì)胞自身因素的作用,另一方面還受到睪丸和附睪微環(huán)境的影響[1],此外還受到一些生物因子的作用。研究表明,在睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞、附睪輸出小管上皮、前列腺、精囊及精液等都有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)的表達(dá)[2–4],推測(cè)VEGF和VEGFR2可能與雄性生殖生理相關(guān),但它們?cè)谛坌陨诚到y(tǒng)中的作用和機(jī)理尚不完全清楚。本研究采用免疫組化、免疫熒光技術(shù)在蛋白水平上研究VEGF和VEGFR2在青春期大鼠睪丸、附睪及附睪精子上的表達(dá)定位情況,旨在探討它們?cè)诓G丸精子發(fā)生和附睪精子成熟中的重要作用,為進(jìn)一步明確它們?cè)谛坌陨尺^程中的功能提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)資料。

材料和方法

1.主 要試劑與動(dòng)物組織標(biāo)本的采集與處理

兔抗鼠多克隆VEGF、VEGFR2抗體購(gòu)于美國(guó)Labvision公司,FITC標(biāo)記的山羊抗兔 IgG、SP-9001試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)于北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。選擇7-8周齡、體質(zhì)量150-180 g的青春期健康雄性SD大鼠20只,購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

將出生后第8周大鼠200 g/L烏拉坦5 ml/kg腹腔麻醉,分別取睪丸和附睪組織,用于免疫組化的睪丸、附睪組織迅速入Bouin’s液固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片 5μm。用于免疫熒光的附睪組織,分離周圍脂肪后剪碎,置于500μl 0.01 mol/L (p H7.0-7.4)PBS中沉淀,待沉淀后吸取上清液 (含精子)2200g離心15 min,可重復(fù)兩次;4%多聚甲醛吹打固定30 min之后同上離心,用含50 mmol/L甘氨酸的PBS洗滌,2200g離心15 min后沉淀以0.01 mol/LPBS調(diào)整精子密度至30-40×109/L。將此精子懸液涂在鉻礬明膠處理過的載玻片上,風(fēng)干用于免疫熒光染色。

2免 疫組織化學(xué)染色 (SP法)

采用SP法進(jìn)行免疫組化染色:組織石蠟切片脫臘至水后,在0.01 mol/L (p H6.0)枸櫞酸緩沖液中微波修復(fù)抗原15 min后冷卻至室溫,30 ml/L雙氧水孵育15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶,10 ml/L TritonX-100浸泡15 min以增加組織的可穿透性,50 ml/L正常羊血清37℃封閉25 min,滴加一抗 (1:100),4℃過夜?；謴?fù)室溫40min,滴加生物素化二抗,37℃孵育1 h,室溫放置40 min,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素37℃孵育25 min,DAB顯色3-5 min,蘇木精復(fù)染1-3 min,常規(guī)脫水、透明、封片。以上各步驟間均用0.01 mol/L p H (7.0-7.4)PBS洗2次,每次5 min。實(shí)驗(yàn)以0.01 mol/Lp H(7.0-7.4)PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。以胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性,并在Olympus BX51顯微鏡下拍照。

3免 疫熒光染色

附睪精子涂片在0.01 mol/L (p H6.0)枸櫞酸緩沖液中微波修復(fù)抗原15 min,冷卻至室溫,30 ml/L H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,10 ml/L TritonX-100中浸泡30 min以增加細(xì)胞的可穿透性,30 ml/L正常山羊血清室溫封閉30 min后加一抗 (1:50),4℃孵育2夜?；謴?fù)室溫40 min后滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1:100),37℃孵育1 h,用甘油—碳酸氫鈉濕封劑封片,以上各步驟間均用0.01 mol/L p H(7.0-7.4)PBS洗3次,每次 5 min。實(shí)驗(yàn)以 0.01 mol/Lp H (7.0-7.4)PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。以出現(xiàn)較強(qiáng)黃綠色熒光為陽(yáng)性,并用Olympus BX51熒光顯微鏡拍照。

結(jié) 果

1.V EGF和VEGFR2在睪丸中的表達(dá)

VEGF與VEGFR2免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色,在正常大鼠睪丸中均有表達(dá)。在睪丸中VEGF陽(yáng)性染色主要位于精原細(xì)胞胞質(zhì)、精子細(xì)胞發(fā)育中的的頂體、Sertoli細(xì)胞胞質(zhì)以及精子殘余體內(nèi),且間質(zhì)中Leydig細(xì)胞胞質(zhì)也有陽(yáng)性表達(dá)(圖Ⅰ-1);其中以發(fā)育中的頂體及精子殘余體的陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)。VEGFR2陽(yáng)性染色主要定位于精子細(xì)胞發(fā)育中的頂體內(nèi) (圖Ⅰ-2),Sertoli細(xì)胞胞質(zhì)弱陽(yáng)性,間質(zhì)中Leydig細(xì)胞胞質(zhì)和部分血管內(nèi)皮及管壁平滑肌亦呈陽(yáng)性染色;精子細(xì)胞的胞質(zhì)、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞均為陰性。

2.V EGF和VEGFR2在附睪中的表達(dá)

在附睪中,VEGF蛋白幾乎表達(dá)于附睪管上皮所有主細(xì)胞胞質(zhì)中,呈粗大的陽(yáng)性顆粒,近管腔游離面的纖毛也呈現(xiàn)陽(yáng)性染色,亮細(xì)胞、暈細(xì)胞及基細(xì)胞未見陽(yáng)性染色。VEGF在附睪體部表達(dá)最強(qiáng),頭部次之,尾部和始段表達(dá)較弱。該蛋白在附睪上皮中的表達(dá)呈現(xiàn)細(xì)胞特異性和區(qū)段特異性 (圖Ⅰ-3～6)。VEGFR2陽(yáng)性染色主要定位于附睪管上皮主細(xì)胞胞質(zhì),部分間質(zhì)小血管內(nèi)皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮也呈陽(yáng)性染色,而亮細(xì)胞、基細(xì)胞及暈細(xì)胞均為陰性。該蛋白在附睪尾部表達(dá)最強(qiáng)、頭部和起始段次之,體部未見陽(yáng)性表達(dá) (圖Ⅰ-7-10)。

3.附 睪精子免疫熒光染色

以精子出現(xiàn)黃綠色熒光為陽(yáng)性表達(dá)。VEGF與VEGFR2均可與精子頭部頂體、尾部頸段、中段和主段相結(jié)合,呈較強(qiáng)的黃綠色熒光,而末段與精子核未見陽(yáng)性熒光染色 (圖Ⅰ-11,12)。

討 論

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)是內(nèi)皮細(xì)胞特異性強(qiáng)效有絲分裂原,也是公認(rèn)作用最強(qiáng)的血管通透因子,VEGFR2是血管形成和血管生成的主要調(diào)節(jié)者;它們不僅在內(nèi)皮細(xì)胞上有表達(dá),在非內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá)。國(guó)外有學(xué)者[2–4]報(bào)道 VEGF及其受體VEGFR2在人的睪丸、附睪、精囊和前列腺組織中均有表達(dá),提示其可能與雄性生殖有關(guān)。但是,VEGF與VEGFR2是通過作用于睪丸和附睪的血管系統(tǒng)還是直接作用于生殖細(xì)胞而影響精子的發(fā)生和成熟仍不是很清楚。

研究以健康的青春期大鼠為對(duì)象,用免疫組化和免疫熒光在蛋白水平上較全面的檢測(cè)了VEGF及VEGFR2在睪丸、附睪和附睪內(nèi)精子上的表達(dá),結(jié)果顯示VEGF在大鼠睪丸生精上皮內(nèi)有表達(dá),其中以精原細(xì)胞胞質(zhì)、精子細(xì)胞發(fā)育中的頂體、精子殘余體和支持細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)較強(qiáng)。VEGF在精原細(xì)胞的表達(dá)提示VEGF可能參與精原細(xì)胞有絲分裂的增殖分化過程,促進(jìn)了精子的發(fā)生。已有研究表明,許多基因參與了頂體的形成,本研究發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)伴隨精子細(xì)胞頂體發(fā)育的全過程,這提示在頂體形成過程中VEGF也發(fā)揮了重要作用,提示可將其作為頂體發(fā)育的重要標(biāo)志之一;其在精子殘余體上的較強(qiáng)表達(dá)表明VEGF可能參與精子變態(tài)過程,調(diào)節(jié)其中某些相關(guān)基因的表達(dá);生精細(xì)胞的分化增殖必須在適宜的微環(huán)境中完成,VEGF在Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞上的表達(dá)說明,VEGF在這些細(xì)胞的分泌可能參與了自身的分泌活動(dòng)和睪丸微環(huán)境的調(diào)節(jié)。在體內(nèi)VEGF只有通過與其受體相結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),而VEGFR2是其最主要的受體之一。研究證明了VEGFR2不僅在睪丸生精上皮精子細(xì)胞發(fā)育中的頂體、精子殘余體中有較強(qiáng)表達(dá),在 Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞胞質(zhì)也有表達(dá),這些表達(dá)特點(diǎn)提示VEGF可能通過與VEGFR2相結(jié)合,調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的分泌活動(dòng),為生精細(xì)胞的增殖和分化創(chuàng)造條件;而 VEGF與VEGFR2在 Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞上的同時(shí)表達(dá)說明,它們可能通過直接與自身受體的結(jié)合促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌睪酮,參與睪丸微循環(huán)的構(gòu)建,維持并促進(jìn)精子的發(fā)生。本結(jié)果與 Collin[5]等在人睪丸 Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞內(nèi)的研究基本一致,而與Angele等[6]在小鼠睪丸生殖細(xì)胞上的研究不完全一致,可能與種屬差異、機(jī)體的健康狀態(tài)有關(guān)。此外,有研究表明[7–9],VEGF在睪丸中的表達(dá)也與睪丸血管發(fā)生、新生血管形成有密切關(guān)系,提示VEGF還可能以旁分泌形式作用于間質(zhì)血管的VEGFR2蛋白,調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的通透性。

研究還顯示VEGF及其受體VEGFR2在附睪管上皮主細(xì)胞中也有表達(dá),VEGF在附睪體部表達(dá)最強(qiáng),頭部次之,尾部和始段表達(dá)較弱,其表達(dá)具有細(xì)胞特異性和區(qū)域特異性;而VEGFR2的表達(dá)也呈現(xiàn)細(xì)胞特異性和區(qū)域特異性,但從附睪起始段到尾段,其陽(yáng)性染色以尾部最強(qiáng),頭部次之,起始段最弱而體部陰性。本結(jié)果與Johnston等[10–11]在小鼠附睪中的研究結(jié)果基本相同。以上表達(dá)特點(diǎn)提示附睪上皮主細(xì)胞分泌大量的VEGF蛋白可能通過與自身胞質(zhì)內(nèi)的的VEGFR2作用,調(diào)節(jié)其自身的吸收和分泌功能,進(jìn)而影響附睪管腔液的組成及精子成熟的微環(huán)境,參與精子的睪丸后成熟。在附睪中附睪功能的發(fā)揮具有明顯的區(qū)段特異性,多種與精子成熟有關(guān)的蛋白質(zhì)和多肽在附睪的不同區(qū)段被分泌,VEGF及VEGFR2在附睪中表達(dá)的區(qū)段特異性說明兩蛋白不僅參與構(gòu)建精子附睪內(nèi)成熟的微環(huán)境,共同調(diào)節(jié)附睪微循環(huán)的生理功能,而且各自可能作為特殊物質(zhì)在精子的附睪成熟過程中發(fā)揮不同的作用。

Obermair等[12]首次用免疫熒光法在人類的精子表面定位了VEGF及VEGFR2。本研究免疫熒光法檢測(cè)了VEGF及VEGFR2在大鼠附睪精子上的定位,他們?cè)诰颖砻娌煌瑓^(qū)段表達(dá)的特點(diǎn)表明,精子在循附睪頭、體、尾移行過程中發(fā)生的各種變化可能與VEGF和VEGFR2相關(guān),他們可能通過與周圍微環(huán)境之間的相互作用,改變精子的表面結(jié)構(gòu),在精子受精能力和運(yùn)動(dòng)能力的獲得中發(fā)揮重要作用。

研究VEGF和VEGFR2在大鼠睪丸、附睪及附睪精子上的表達(dá)定位和特點(diǎn),提示它們可能以自分泌或旁分泌的形式共同調(diào)節(jié)睪丸和附睪的微環(huán)境,并可直接或間接的影響精子的發(fā)生、發(fā)育和成熟,特別是精子頂體的形成過程,但要完全闡明它們?cè)谛坌陨持械淖饔眉捌湎嚓P(guān)機(jī)制仍需作進(jìn)一步的研究。

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圖 版 說 明

VEGF和VEGFR2在青春期大鼠睪丸、附睪及附睪精子上的免疫組化和免疫熒光表達(dá)

圖1-10:DAB染色,蘇木精復(fù)染;圖11、12:熒光染色。標(biāo)尺=50μm

1:VEGF在睪丸中的表達(dá),VEGF在精原細(xì)胞、精子細(xì)胞、Sertoli和Leydig細(xì)胞胞質(zhì)陽(yáng)性;2:VEGFR2在睪丸中的表達(dá),VEGFR2表達(dá)于精子細(xì)胞發(fā)育中的頂體和Leydig細(xì)胞。黑、紅色箭頭分別示Leydig細(xì)胞、精子細(xì)胞發(fā)育中的頂體。3～6:VEGF在附睪中的表達(dá),主細(xì)胞胞質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性;分別為附睪的頭、體、尾和尾部,體部表達(dá)最強(qiáng)。7～10:VEGFR2在附睪中的表達(dá),主細(xì)胞核上區(qū)陽(yáng)性;分別為附睪的頭、體、尾和頭部,體部陰性。黑色、綠色和紅色箭頭分別示附睪上皮亮細(xì)胞、基細(xì)胞和暈細(xì)胞,在三種細(xì)胞中VEGF和 VEGFR2均表達(dá)陰性。11、12:VEGF和VEGFR2在精子上的表達(dá),VEGF和 VEGFR2均定位于精子頭部的頂體,尾部的頸段、中段和主段。

EXPLANATION OF FIGURES

Immunohistochemical and immunofluorescent expression of VEGF and VEGFR2 proteins in the adolescent rat testis,epididymis and spermatozoa

Fig.1-10:DAB with haematoxyl in counterstain;Fig.11,12:fluorescent stain.Scale=50μm

1:In the testis,VEGF immunoreactive particles were localized in the cytoplasm of spermatogoniums,spermatids,Sertoli cells and Leydig cells;2:VEGFR2 observed in the testis,it was mainly in the forming acrosome of spermatids and Leydig cells.Black and red arrows respectively indicateing Leydig cells and developing acrosome of spermatids.3-6:VEGF was observed in the caput,corpus,cauda and cauda of the epididymis,it strongly expressed in the cytoplasm of principle cells and strongly expressed in the corpus.7-10:VEGFR2 was showed in the caput,corpus,cauda and caput of the epididymis,it expressed in the supranuclear region of the principle cells,but not found in the corpus.Black,green and red arrows indicate the clear cell,basal cell and halo cell respectively,in which VEGF and VEGFR2 immunon-reactive were not detected.11,12:VEGF and VEGFR2 were both localized in acrosome of spermatozoa head and neck,middle and principal segments of spermatozoa tail