趙舒武 高英茂 汪 濤 王曉玲 魏 斌

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室,天津300193;2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室,濟(jì)南250012)

缺氧缺血性腦損傷是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康、影響生活質(zhì)量的常見(jiàn)病和多發(fā)病。對(duì)缺氧缺血性腦損傷的研究是多年來(lái)神經(jīng)科學(xué)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)和難點(diǎn),對(duì)該病的治療至今仍無(wú)重大突破。近年來(lái)葡萄糖在缺氧缺血性腦損傷中的作用日益受到關(guān)注。葡萄糖對(duì)神經(jīng)組織的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用已為人們所熟知,但對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞缺氧性損傷有無(wú)保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞作為細(xì)胞模型,在缺氧前后加入不同濃度的葡萄糖,觀察神經(jīng)干細(xì)胞的存活、增殖、凋亡及分化情況,以探討葡萄糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用。

材料和方法

1.實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物

雌性成年未經(jīng)產(chǎn)Wistar大鼠由山東大學(xué)西校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,常規(guī)飼養(yǎng)。

2.實(shí) 驗(yàn)試劑

DMEM/F12(1:1) (Hyclone),B27(Invitrogen),堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)和多聚賴(lài)氨酸 (Sigma)、胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS,杭州四季青生物技術(shù)有限公司),抗nestin IgG(孫晉浩副教授惠贈(zèng)山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院),熒光FITC標(biāo)記二抗 (武漢博士德生物工程有限公司),50%葡萄糖注射液 (山東濟(jì)南永寧制藥有限公司),兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (neuron-specific enolase,NSE)多克隆抗體和兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體、PowerVisionTM免疫組化試劑盒和DAB試劑盒 (北京中山金橋生物技術(shù)有限公司),AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒 (Sigma)

3.實(shí) 驗(yàn)方法

3.1 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1]。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組

3代神經(jīng)干細(xì)胞,部分接種于含葡萄糖終濃度分別為15mmol/L和30mmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基中,放入5%三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h,用不含葡萄糖無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2-3次,然后接種于正常的無(wú)血清培養(yǎng)基中,放入37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)48h;部分先于5%三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)120h,然后分別用含葡萄糖終濃度為15mmol/L和30mmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2-3次,再接種于含葡萄糖終濃度分別為15mmol/L和30mmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基中繼于37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)48h;同時(shí)設(shè)5%O2120h常糖缺氧組和常糖常氧正常對(duì)照組。每組均設(shè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.3 檢測(cè)指標(biāo)

3.3.1 干細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞作梯度倍數(shù)稀釋接種于35mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行缺氧干預(yù)。細(xì)胞培養(yǎng)7d時(shí),取對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿放置在一張帶網(wǎng)格的透明膠片上,在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù),計(jì)算公式如下:克隆形成率 (%)=單位面積克隆數(shù)/單位面積接種細(xì)胞數(shù)×100

3.3.2 檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡

分別收集對(duì)照和各實(shí)驗(yàn)組的神經(jīng)干細(xì)胞,DHank’s液洗滌兩次,用binding buffer制備細(xì)胞懸液,隨即加入 5μlAnnexin Ⅴ-FITC和 10μl PI,室溫避光顯色15min,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照,采用機(jī)器配套軟件計(jì)算細(xì)胞總數(shù),處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率為凋亡率。

3.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示,采用 SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,各組率的比較采用χ2檢驗(yàn)法 (Chi-square test),各組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析,多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較選用 q檢驗(yàn) (Newman-Keuls法)。

結(jié) 果

1.培 養(yǎng)細(xì)胞的觀察

細(xì)胞接種24h后見(jiàn)細(xì)胞分裂相,細(xì)胞飽滿(mǎn),折光性強(qiáng),第3d有數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),呈懸浮狀態(tài)。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),最終形成由數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的神經(jīng)球。5%O2120h組中形成神經(jīng)球數(shù)量明顯減少,且神經(jīng)球的細(xì)胞折光性較弱,邊緣細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則或不完整,可見(jiàn)有絲絮狀物和較多細(xì)胞碎片。缺氧后高糖組 (包括 15mmol/L組和30mmol/L組)神經(jīng)球的狀態(tài)與5%O2120h組相比無(wú)明顯改善。相反,缺氧前30mmol/L葡萄糖組中神經(jīng)球數(shù)量較5%O2120h組顯著增多,細(xì)胞較豐滿(mǎn),折光性較好,神經(jīng)球邊緣細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則,細(xì)胞碎片較少。

2.干 細(xì)胞克隆形成率檢測(cè)結(jié)果

由圖1可見(jiàn),缺氧前30mmol/L組克隆形成率顯著高于5%O2120h組 (P<0.01),但是仍然顯著低于正常對(duì)照組 (P<0.01);缺氧后各高糖組的克隆形成率與5%O2120h組相比無(wú)明顯改善(P>0.05)。

圖1 缺氧前后高糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞克隆形成率的影響(%)Fig.1 Influence of high glucose on neural stem call before and after hypoxia(%)注:＊P<0.01與正常對(duì)照組比較 (Compared with normal control group),△P<0.01與5%O2120h組比較(Compared with 5%O2120h group)

3.細(xì) 胞凋亡率檢測(cè)

激光掃描共聚焦顯微鏡下顯示,缺氧后高糖組和5%O2120h組可見(jiàn)較多的紅染和綠染細(xì)胞,比較而言,缺氧前30mmol/L高糖組中紅染和綠染細(xì)胞較少 (圖2-4),但仍多于正常對(duì)照組。由圖5也可得出同樣的結(jié)果:缺氧后高糖組和5%O2120h組凋亡率顯著高于正常對(duì)照組 (P<0.01);缺氧前30mmol/L高糖組凋亡率較缺氧后高糖組和5%O2120h組顯著降低 (P<0.01),然而仍高于正常對(duì)照組 (P<0.01)。

圖2 5%O2120h組凋亡免疫熒光雙染Fig.2 AnnexinⅤ-FITC/PI staining,showing many apoptotic NSCs in 5%O2120h group圖3缺氧前添加30mmol/L葡萄糖組的凋亡免疫熒光雙染Fig.3 AnnexinⅤ-FITC/PI staining,showing apoptotic NSCs in 30mmol/L glucose added before hypoxia group圖4缺氧后添加30mmol/L葡萄糖組的凋亡免疫熒光雙染Fig.4 AnnexinⅤ-FITC/PI staining,showing apoptotic NSCs in 30mmol/L glucose added after hypoxia group

圖5 缺氧前后高糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率的影響 (%)Fig.5 Influcece of high glucose on apoptotic rate of neural stem cell before and after hypoxia(%)注:＊P<0.01與正常對(duì)照組比較 (Compared with normal group),△P<0.01與5%O2120h組比較 (Compared with5%02120h group)

討 論

缺氧缺血性腦損傷發(fā)病率逐年上升,然而人們對(duì)其發(fā)病機(jī)理還不甚明了,更無(wú)根本性的治療措施。近年來(lái)葡萄糖在缺氧缺血性腦損傷中的作用日益受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以胚胎11.5天神經(jīng)干細(xì)胞為體外細(xì)胞模型,觀察缺氧前后分別添加不同濃度的葡萄糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖、凋亡的影響。

結(jié)果顯示,缺氧前添加足夠濃度的葡萄糖可減輕缺氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的損傷。缺氧前30mmol/L葡萄糖組對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用顯著,而缺氧前15mmol/L葡萄糖組對(duì)缺氧損傷的保護(hù)作用不明顯,分析應(yīng)該與所給予的葡萄糖濃度不足有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道葡萄糖需達(dá)到一定的濃度才可起到腦保護(hù)的作用。缺氧時(shí),由于能量供應(yīng)匱乏,細(xì)胞可通過(guò) HIF-1調(diào)節(jié)代謝途徑,主要依靠無(wú)氧酵解提供ATP。故缺氧前乏糖減少腦能量代謝的底物,不僅可進(jìn)一步加重腦的功能障礙,而且由此可引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)加劇腦損傷[2]。葡萄糖除作為能量物質(zhì)合成ATP外還參與合成代謝,從腦發(fā)育開(kāi)始至腦發(fā)育結(jié)束葡萄糖都起著極其重要的作用,葡萄糖的供應(yīng)缺陷將導(dǎo)致腦的發(fā)育障礙[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道,在缺氧缺血性損傷時(shí),高濃度葡萄糖可使細(xì)胞內(nèi)乳酸積聚增加數(shù)倍,因而加重細(xì)胞內(nèi)酸中毒而加劇腦細(xì)胞損傷[4-5]。Young RS等的研究發(fā)現(xiàn)雖然高濃度葡萄糖對(duì)成體缺氧缺血性腦損傷是有害因素,但對(duì)處于發(fā)育期動(dòng)物的缺氧缺血性腦損傷高濃度葡萄糖不會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)乳酸積聚[6]。我們的研究顯示一定濃度的葡萄糖減輕缺氧對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的損傷,與文獻(xiàn)報(bào)道不盡一致,分析原因可能為二:其一我們所選取的葡萄糖的濃度范圍不夠大;其二是我們所選用的細(xì)胞模型為大鼠E11.5天神經(jīng)管神經(jīng)干細(xì)胞,屬發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞,它的生物學(xué)特性不能完全等同于成體細(xì)胞,另外在體實(shí)驗(yàn)與體外培養(yǎng)也會(huì)存在一定的差異 。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示缺氧后添加葡萄糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞不能起到保護(hù)作用。究其原因可能為因缺氧損傷的細(xì)胞其葡萄糖代謝能力已經(jīng)喪失,即使再添加葡萄糖也不能阻止細(xì)胞已啟動(dòng)的程序性死亡途徑。

目前關(guān)于葡萄糖對(duì)缺氧缺血性腦損傷的腦保護(hù)作用尚存有爭(zhēng)議[7-8]。就目前的研究來(lái)看,低血糖的損傷作用和高血糖的保護(hù)作用在缺氧缺血性損傷之前可能更為明顯。葡萄糖對(duì)缺氧缺血性腦損傷的作用可能與細(xì)胞的成熟度和來(lái)源的部位也存在密不可分的關(guān)系。其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

〔1〕趙舒武,高英茂,張曉麗,等.鈣離子與缺氧性神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2007,16(5):575-579

〔2〕Vannucci R C,Vannucci SJ.Glucose metabolism in the developing brain.Semin Perinatol,2000,24(2):107-115

〔3〕Medina J M,Tabernero A,Tovar J A,et al.Metabolic fuel utilization and pyruvate oxidation during the postnatal period.J Inher Meta Dis,1996,19:432-442

〔4〕Siesjo BK,Katsura KI,Kristian T,et al.Molecular mechanisms ofacidosis-mediated damage. Diabetes,1996,45(11):1605-1609

〔5〕陳曉紅,邊連防,伍愛(ài)民,等.高糖對(duì)缺氧神經(jīng)元的影響及鈣相關(guān)機(jī)制研究.中國(guó)神經(jīng)科學(xué)雜志, 2000,16(4):326-329

〔6〕Young RS,Petroff OA,Aquila WJ,et al.Hyperglycemia and the rate of lactic acid accumulation during cerebral ischemia in developing animals:in vivo proton MRS study.Biol Neonate,1992,61(4):235-242

〔7〕Mc Gowan J E,Marro PJ,Mishra OP,et al.Brain cell membrane function during hypoxia in hyperglycemic new born piglets.Pediatr Res,1995,37:133-139

〔8〕Park W S,Chang Y S,and Lee M.Effects of hyperglycemia or hypoglycemia on brain cell membrane function and energy metabolism during the immediate reoxygenation reperfusion period after acute transient global hypoxia ischemia in the new born piglet.Brain Res,2001,901:102-108