楊 帆 姜 蕊 韓俊慶 王勝昔 宋 偉

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院腫瘤研究治療中心,濟(jì)南,250021)

胃癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一,患者多死于侵襲、轉(zhuǎn)移。目前研究認(rèn)為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn) 化 (epithelial– mesenchymaltransition,EMT)對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有重要影響[1]。EMT是指一定條件下上皮細(xì)胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變成類似間質(zhì)細(xì)胞,同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性,具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間移動(dòng)。在分子水平研究發(fā)現(xiàn):發(fā)生EMT的上皮性腫瘤細(xì)胞,其上皮細(xì)胞標(biāo)志 E-cadherin表達(dá)減少或缺失[2],而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志N-cadherin卻異常高表達(dá)[3]。TGF-β1及轉(zhuǎn)錄因子Snail被認(rèn)為通過下調(diào) E-cadherin的表達(dá)參與調(diào)節(jié)EMT。為研究胃癌細(xì)胞 EMT現(xiàn)象的發(fā)生及其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響,我們以胃癌AGS細(xì)胞株為研究對(duì)象,觀察 TGF-β1對(duì)AGS細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和增殖的影響,以及對(duì)snail、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)和體外侵襲力的影響。

材料和方法

1.材料 胃癌細(xì)胞株AGS由山東省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存,TGF-β1購自美國 Peprotech公司,基質(zhì)膠Matrigel購自BD公司,Transwell侵襲小室購于Corning公司,兔抗人Snail單克隆抗體購自Abcam公司 (17732),鼠抗 E-cadherin單克隆抗體及鼠抗N-cadherin單克隆抗體均購自北京中杉生物技術(shù)公司 (ZM0094);山羊抗兔 IgG(H+L)/FITC和山羊抗小鼠IgG(H+L)/TRITC標(biāo)記的熒光二抗均購自北京鼎國生物有限責(zé)任公司;MTT購自南京大冶生物科技有限公司。

2.方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) AGS用含 10%胎牛血清,100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的 1640培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)于5%CO2,37℃人工培養(yǎng)箱中,每2-3d傳代一次。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 10ng/ml TGF-β1處理細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)3代以后,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

2.3 MTT比色法 收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔5000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,每孔終體積為100μl,于5%CO2,37℃條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后,進(jìn)行分組,設(shè):①空白對(duì)照組:無 TGF-β1;②實(shí)驗(yàn)組:分別加入 1、2、5、10、20、50ng/ml六組終濃度的 TGF-β1,且每一組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24h。終止培養(yǎng)前4h每孔加入 MTT 20μl,孵育完畢后吸除孔內(nèi)上清液,每孔加入150μl DMSO,微型振蕩器振蕩10min,使紫色結(jié)晶物充分溶解。以空白對(duì)照孔調(diào)整零點(diǎn),酶聯(lián)免疫分析儀上測(cè)定490nm波長處每孔吸光的光密度值。以上試驗(yàn)重復(fù)3次,以每組平均光密度值 (MOD)代表細(xì)胞增殖能力的大小。

2.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) AGS細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中 (細(xì)胞數(shù)約為每孔2×105個(gè)),待長到完全融合時(shí),用200μl微量移液槍頭在6孔板內(nèi)單層細(xì)胞上垂直劃痕,劃痕后用 PBS沖洗2次,同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組中加入10ng/ml的 TGF-β1,繼續(xù)培養(yǎng)。每24 h于倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合程度并拍照。

2.5 Transwell侵襲試驗(yàn) 應(yīng)用24孔 Transwell侵襲小室進(jìn)行侵襲試驗(yàn),將Matrigel膠以1:3比例用無血清1640稀釋后,取50μl鋪于 Transwell上室中,置于37℃培養(yǎng)箱中,5h后,待上室的聚碳酸酯膜-Matrigel聚合后,收集對(duì)數(shù)生長期AGS細(xì)胞,以200μl無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液加入上室孔中,細(xì)胞濃度為1x105個(gè)/孔,下室中加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為10ng/ml的 TGF-β1,對(duì)照組加入等量PBS作為趨化劑,培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后取出Transwell小室,將上室中的Matrigel膠和附著的細(xì)胞用濕棉簽擦去,4%冰多聚甲醛固定,蘇木素染色,高倍鏡下計(jì)數(shù)膜背面上的穿膜細(xì)胞數(shù)。

2.6 免疫熒光檢測(cè)snail、E-cdaherin和N-cadherin的表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長期的AGS細(xì)胞制備細(xì)胞爬片,實(shí)驗(yàn)組加入10ng/ml TGF-β1,48h后取出,4%冰多聚甲醛固定30min,常規(guī)免疫熒光染色,一抗分別為兔抗人 Snail(1:800)、鼠抗 E-cadherin單克隆抗體和鼠抗N-cadherin單克隆抗體。一抗4℃過夜后,加入特異性熒光二抗,37℃孵育2h,DAPI染細(xì)胞核。陰性對(duì)照試驗(yàn)中,用PBS代替一抗以排除非特異性的二抗結(jié)合。

2.7 Western blot 以平皿常規(guī)培養(yǎng)A GS細(xì)胞,其中實(shí)驗(yàn)組加入10ng/ml的 TGF-β1,48h后收集細(xì)胞,加入適當(dāng)細(xì)胞裂解液,冰浴30min,離心取上清,Brandford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后,取30μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE,電泳完畢后,應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀將樣品轉(zhuǎn)移至 PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,兔抗人Snail(1:800)、鼠抗 E-cadherin單克隆抗體和鼠抗N-cadherin單克隆抗體4℃孵育過夜,洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性二抗37℃孵育1h,洗膜后加入DAB顯色。以內(nèi)參 (βactin)作為陽性對(duì)照,凝膠圖象處理系統(tǒng)成像。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理系統(tǒng),所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (ˉx±s)表示,采用單因素方差分析,P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

結(jié) 果

1.T GF-β1對(duì)AGS細(xì)胞形態(tài)變化的影響

在10ng/ml TGF-β1刺激后,通過相差顯微鏡觀察到AGS細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的多邊樣形態(tài),表現(xiàn)為類似成纖維細(xì)胞,部分細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞的排列較為雜亂 (圖1A)。

2.T GF-β1對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響

低濃度 (1、2、5、10ng/ml)TGF-β1促進(jìn)細(xì)胞增殖,在10ng/ml時(shí)作用最強(qiáng),而高濃度 (20、5 0ng/ml)TGF-β1時(shí)細(xì)胞增殖率逐步降低,且呈劑量依賴性 (圖2)。

3.細(xì)胞遷移力的改變 劃痕后,與對(duì)照組相比,加入10ng/ml TGF-β1繼續(xù)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組,細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)。同樣的,應(yīng)用未鋪Matrigel膠的 Transwell侵襲小室進(jìn)行細(xì)胞遷移試驗(yàn),結(jié)果也發(fā)現(xiàn)10ng/ml TGF-β1作用的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移能力與對(duì)照組比較大大增強(qiáng) (圖3)。

4.Transwell體外侵襲試驗(yàn) Transwell小室培養(yǎng)細(xì)胞24h后,AGS細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為58.33±5.859,實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)為105.67±4.041,兩者相比差異具有顯著性 (P<0.05)(圖1 B)。

5.TGF-β1作用后 Snail及上皮、間質(zhì)標(biāo)志蛋白的改變 免疫熒光和 Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,加入 10ng/ml TGF-β1作用后,Snail蛋白表達(dá)增強(qiáng),E-cadherin表達(dá)下降,而N-cadherin表達(dá)升高。然而,應(yīng)用免疫熒光未檢測(cè)到E-cadherin的表達(dá) (圖1 C,D;圖4)。

討 論

以往研究中證實(shí)大量的生長因子可以誘導(dǎo)發(fā)生EMT[2],其中 TGF-β1是目前研究最廣泛細(xì)胞因子之一[4]。Bakin AV[5]等將NmuMG乳腺上皮細(xì)胞暴露在外源性 TGF-β1中,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)梭形形態(tài),E-cadherin等細(xì)胞間粘附分子表達(dá)下調(diào),而伴隨侵襲能力的增強(qiáng),具有EMT樣表型。特別注意的是TGF-β1在腫瘤發(fā)展中扮演著雙重角色[6]:一方面,它作為腫瘤生長抑制因子,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖;另一方面,在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中,TGF-β1卻起促進(jìn)腫瘤生長的作用,同時(shí)可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生 EMT,間接促進(jìn)其侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn),低濃度 (1、2、5、10ng/ml)TGF-β1對(duì)胃腺癌細(xì)胞株AGS具有促進(jìn)增殖的作用,在10ng/ml時(shí)作用最大;而較高濃度 (20、50ng/ml)TGF-β1時(shí)細(xì)胞增殖逐步降低。

上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT現(xiàn)象后,其細(xì)胞-細(xì)胞之間連接減弱、重要的細(xì)胞骨架發(fā)生重組、細(xì)胞極性喪失,最終導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變;同時(shí)獲得運(yùn)動(dòng)和侵襲能力[7],從而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究通過外源性 TGF-β1作用于胃腺癌細(xì)胞株AGS,使AGS由常規(guī)培養(yǎng)條件下的多邊樣上皮形態(tài),轉(zhuǎn)變成類似間充質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài),在形態(tài)學(xué)上證實(shí)了EMT的改變。已有多個(gè)研究證明上皮來源的腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象后,細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng),本研究通過細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和 Transwelll侵襲試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。我們應(yīng)用免疫熒光和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Snail和細(xì)胞間粘附分子發(fā)現(xiàn):胃癌細(xì)胞AGS發(fā)生EMT現(xiàn)象后,其細(xì)胞間粘附分子E-cadherin表達(dá)下調(diào),而N-cadherin和 Snail表達(dá)上調(diào)。

E-cadherin、N-cadherin同屬經(jīng)典的鈣粘蛋白家族,主要參與細(xì)胞間連接,二者與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,其中 E-cadherin的表達(dá)下調(diào)或缺失,被認(rèn)為是 EMT的標(biāo)志。Snail是一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)展過程中,可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。Snail通過與靶基因上含有的CAGGTG堿基序列的 E-box作用元件結(jié)合,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用,從而調(diào)節(jié)其表達(dá)[8]。目前認(rèn)為 ECadherin是Snail直接作用的靶基因,Snail通過抑制E-Cadherin的表達(dá),減少細(xì)胞間的粘附連接,從而使上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性。而 TGF-β1可以通過 PI3K信號(hào)通路,誘導(dǎo) A KT的激活,介導(dǎo)Snail的表達(dá)上調(diào)和 E-cadherin的表達(dá)下調(diào)[9]。本研究通過 TGF-β1作用于AGS細(xì)胞株后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了 Snail的表達(dá)上調(diào),也證實(shí)了TGF-β1可能通過介導(dǎo) Snail的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT,而增強(qiáng)侵襲和遷移的能力。

EMT是一個(gè)可逆的過程,目前已有研究應(yīng)用干擾 TGF-β1、Snail等基因的表達(dá),及重新表達(dá)E-cadherin等基因的方法來逆轉(zhuǎn) EMT過程,從而降低腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,這可能為腫瘤的臨床治療提供一個(gè)新的思路。

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圖 版 說 明

圖1 A.TGF-β1對(duì)AGS細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影晌?！?00

B.Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果。×200

C.免疫熒光檢測(cè)Snail表達(dá)結(jié)果。×400

D.免疫熒光檢測(cè)N-cadherin表達(dá)結(jié)果。×200

1.對(duì)照組;2.10ng/ml TGF-β1實(shí)驗(yàn)組

圖2不同濃度 TGF-β1對(duì)AGS增殖的影響

圖3細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果

1.對(duì)照組;2.10ng/ml TGF-β1實(shí)驗(yàn)組。

圖4 Snail、N-cadherin及 E-cadherin蛋白質(zhì)印跡結(jié)果1-2.對(duì)照組;3-4.10ng/ml TGF-β1實(shí)驗(yàn)組。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 A.The effect of TGF-β1 on the morphology change of AGS cells.×200

B.Result of transwell invision experiment.×200

C.Expresion of Snail was detected by immunofluorescence.×200

D.Expresion of N-cadherin detected by immunofluorescence.×200

1.Control group;2.Experimental group with 10ng/ml TGF-β1.

Fig.2 Theeffect of different concentration of TGF-β1 on the

proliferation of AGS detected by MTT.

Fig.3 Results of cellscratch test.

1.Control group;2.Experimental group with 10ng/ml TGF-β1

Fig.4 Results of the expression of Snail,N-cadherin and E-cadherin by Western blot.

1-2.Control group;3-4.Experimentalgroup with 10ng/ml TGF-β1.