徐勝美 馬紅梅 郭 東

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田醫(yī)院病理科,深圳518033)

大腸癌 (colorectal carcinoma,CRC)是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤。在美國(guó)和多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家,CRC的病死率居癌癥病死率的第2位,在全世界范圍居第4位[1]。在中國(guó),CRC的發(fā)病率位于全部惡性腫瘤的第4-6位,居消化系統(tǒng)的第2-3位。

材料和方法

1 材料

1.1 病例選擇收集深圳市福田人民醫(yī)院普外科2002年1月-2006年12月間經(jīng)手術(shù)切除的102例CRC及正常黏膜組織的石蠟標(biāo)本。102例CRC患者中,男性66例,女性36例;年齡31-88(平均58)歲;腺癌83例,粘液腺癌15例,印戒細(xì)胞癌4例:高分化癌58例,中分化癌25例,低分化癌19例;DukesA期13例,B期43例,C期28例,D期18例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例,未轉(zhuǎn)移62例;遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移18例,未轉(zhuǎn)移84例。14例大腸腺瘤取自經(jīng)結(jié)腸鏡切除的患者。

1.2 Western blotting的材料本實(shí)驗(yàn)收集18例2006年1月至2007年11月深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院普外科手術(shù)切除的CRC組織標(biāo)本以及距腫瘤5cm以上的相對(duì)照正常大腸黏膜組織標(biāo)本。標(biāo)本切取后,部分立即用生理鹽水沖洗干凈,放入凍存管中,置入-80℃冰箱中保存,用以Western blotting方法檢測(cè)。

2.方 法

2.1 免疫組化采用SABC法,選用武漢博士德生物工程有限公司提供的ICAM-1(BA0541,1:100)濃縮型一抗和即用型SABC試劑盒 (SA1022)。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切片厚4μm。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,透明,封固。選用ICAM-1蛋白的典型陽(yáng)性病例作為陽(yáng)性對(duì)照,陰性對(duì)照以PBS緩沖液替代一抗。

2.2 免疫組化的判定標(biāo)準(zhǔn)采用半定量積分法,綜合考慮陽(yáng)性細(xì)胞百分率和顯色強(qiáng)度來(lái)判定結(jié)果[2]:計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率并賦予分值,≤5%為0分,6%-25%為1分,26%-50%為2分,51%-75%為3分,>75%為4分;觀(guān)察顯色強(qiáng)度并賦予分值,無(wú)著色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。兩者相乘,0分為 (-),1-12分為 (+)。

2.3 Western blotting組織蛋白提取按照Mammalian Cell Extraction K it試劑盒的操作步驟進(jìn)行,電泳蛋白樣品的制備,SDS-PAGE電泳,半干電轉(zhuǎn)印,免疫反應(yīng),用凝膠成像系統(tǒng)拍照留永久的記錄。

2.4 Western blotting的判斷標(biāo)準(zhǔn) Western blotting結(jié)果顯示NC膜上的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品共顯出7條藍(lán)色條帶,依次為215KD、120KD、84K D、60K D、39.2K D、28K D、18.3KD。同時(shí)NC膜上有深紫色的特異性條帶出現(xiàn),即為該蛋白陽(yáng)性表達(dá),無(wú)可見(jiàn)的條帶出現(xiàn)即為該蛋白陰性表達(dá)。管家蛋白β-actin作為內(nèi)參照,其檢測(cè)條帶大約在42KD。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.ICAM-1蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示ICAM-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)以細(xì)胞膜彌散或灶狀著色為主,細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá) (圖1-3)。ICAM-1蛋白在正常黏膜的低表達(dá)和腺瘤、癌組織中的高表達(dá),差異均有顯著性 (P<0.001,表1)。

表1 各組ICAM-1的蛋白表達(dá)T able 1 Protein expressions in each group

2.ICAM-1蛋白在CRC組織中表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示 CRC組織中ICAM-1蛋白表達(dá)水平與患者的年齡和性別無(wú)關(guān)(P>0.05);隨著分化程度的降低,ICAM-1蛋白表達(dá)越來(lái)越高,但是各組間的差異無(wú)顯著性 (P>0.05);在臨床Dukes分期方面,只有Dukes B與Dukes C、Dukes D期的差異均有顯著性 (P<0.01);淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移組中的 ICAM-1蛋白表達(dá)均高于未轉(zhuǎn)移組,且差異有顯著性 (P<0.01,P<0.05,表2)。

3.ICAM-1的蛋白表達(dá) Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ICAM-1蛋白的特異性條帶出現(xiàn)在Marker標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子量110KD左右,與購(gòu)買(mǎi)的抗體ICAM-1的相對(duì)分子量相符,所有標(biāo)本的內(nèi)參βactin都顯示清晰的條帶,出現(xiàn)在42KD左右 (圖4、5和6)。18例CRC組織中 ICAM-1的陽(yáng)性率為77.8%(12/18);18例正常大腸黏膜組織中ICAM-1的陽(yáng)性率為16.7%(3/18)。經(jīng)過(guò) Fisher確切概率法檢驗(yàn),ICAM-1在CRC與正常黏膜組的表達(dá)差異有顯著性 (P<0.01,表3)。

表2 ICAM-1蛋白在CRC組織中表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Relationship between clinical pathological character and the expression of ICAM-1 in CRL

圖1 ICAM-1蛋白在大腸正常黏膜陰性表達(dá) (SABC法×100)圖2 ICAM-1蛋白在大腸腺瘤陽(yáng)性表達(dá) (SABC法×100)圖3 ICAM-1蛋白在大腸癌細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá) (SABC×200)Fig.1 Negative expression of ICAM-1 protein in normal mucosa,SABC method×100)Fig.2 Positive expression of ICAM-1 protein in adenoma,SABC method×100)Fig.3 Positive expression in CRC,SABC method×200)

表3 ICAM-1在大腸正常黏膜和CRC組織中的表達(dá) (Western bolt)Table 3 Expression of ICAM-1 in normal mucous tissue and CRC(Western blot)

討 論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)動(dòng)態(tài)、復(fù)雜、多步驟的過(guò)程,涉及到同質(zhì)性腫瘤細(xì)胞之間和異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞的黏附性改變以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解。細(xì)胞黏附分子是介導(dǎo)細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接的一類(lèi)跨膜糖蛋白。細(xì)胞黏附分子的的種類(lèi)很多,本實(shí)驗(yàn)研究的是與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-l)。

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成員,廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面。人 ICAM-1基因定位于染色體 19p13.2-13.3,由一長(zhǎng)3.3kb可誘導(dǎo)的mRNA編碼,其蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量在80-110KD。ICAM-1有膜結(jié)合型和可溶性型 (sICAM-1)兩型。正常情況下,內(nèi)皮細(xì)胞僅表達(dá)少量的ICAM-1,而在炎性因子和炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)下上調(diào),主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附作用,此外還參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的生長(zhǎng)移行、免疫炎性反應(yīng)、血管生長(zhǎng)和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等一系列的生理和病理過(guò)程。

既往的研究有兩種不同的發(fā)現(xiàn),一種是腫瘤細(xì)胞表面 ICAM-1蛋白表達(dá)明顯減少,如子宮頸癌[3]和小細(xì)胞肺癌[4]等腫瘤;另一種是肝癌[5]、胃癌[6]和食管癌[7]等腫瘤細(xì)胞中 ICAM-1蛋白表達(dá)明顯高于正常組織,并且有轉(zhuǎn)移者較無(wú)轉(zhuǎn)移者高。先前有人在研究CRC的進(jìn)展中發(fā)現(xiàn),腺癌的ICAM-1的表達(dá)逐漸降低,但間質(zhì)淋巴管內(nèi)皮的陽(yáng)性表達(dá)上升,其結(jié)果影響了黏附分子ICAM-1介導(dǎo)的同質(zhì)性或異質(zhì)性黏附,腺癌的ICAM-1表達(dá)逐漸降低可促進(jìn)癌細(xì)胞從腫瘤組織中脫落下來(lái),而淋巴管內(nèi)皮的陽(yáng)性表達(dá)上升則促使癌細(xì)胞黏附于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而侵襲到了淋巴管而實(shí)現(xiàn)淋巴道的轉(zhuǎn)移。

實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)研究得出CRC和腺瘤中ICAM-1的表達(dá)高于正常黏膜組織 (P<0.001);隨著組織分化的降低,ICAM-1呈增高的趨勢(shì),但是各組織分化組間的差異均無(wú)顯著性 (P>0.05),這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)的樣本量較小,經(jīng)過(guò)分組后,各組的樣本例數(shù)更小,未能體現(xiàn)出總體應(yīng)有的真實(shí)水平;而在Dukes分期方面,只有Dukes B期與C、D期的差異均有顯著性 (P=0.005,P=0.001);即與淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移則呈正相關(guān)。以上的結(jié)果提示CRC組織中癌細(xì)胞的 ICAM-1蛋白表達(dá)增加使其易于發(fā)生轉(zhuǎn)移。其可能的機(jī)制是ICAM-1是淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-1的主要配體,當(dāng)CRC癌細(xì)胞表達(dá)ICAM-1,此時(shí)癌細(xì)胞通過(guò)這種配體與浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞結(jié)合[8],從而隨著淋巴細(xì)胞的遷移進(jìn)入血循環(huán),可能在穿越血管時(shí)免受傷害,易于在毛細(xì)血管內(nèi)或淋巴竇滯留和著床,形成轉(zhuǎn)移灶,其表達(dá)增強(qiáng)有利于淋巴細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮并向組織中浸潤(rùn)。

目前有關(guān)ICAM-1用免疫組織化學(xué)檢測(cè)的研究報(bào)道不少,但Western blotting方法研究 ICAM-1表達(dá)情況的文章還很少報(bào)道。Western blotting有如下優(yōu)點(diǎn):⑴具有高度的特異性,在NC膜上進(jìn)行免疫印跡,利用抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的高度特異性來(lái)檢測(cè)ICAM-1蛋白;⑵應(yīng)用范圍廣,可進(jìn)行半定量和定性分析;⑶對(duì)組織標(biāo)本要求低,可應(yīng)用于冷凍失活組織,故被本實(shí)驗(yàn)采納。本實(shí)驗(yàn)采用Western blotting方法發(fā)現(xiàn)ICAM-1蛋白在CRC的陽(yáng)性率明顯高于正常黏膜組織,且差異有顯著性 (P=0.001),這與免疫組織化學(xué)的結(jié)果是一致的。Western blotting的結(jié)果有力地支持CRC細(xì)胞中ICAM-1蛋白的高表達(dá)可促進(jìn)CRC淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的這種說(shuō)法。

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