謝雪梅 余上斌 劉聲遠(yuǎn) 鄒聰敏 杜 穎 馬萬(wàn)里 朱莉萍 趙建紅 葉 紅＊

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理系,武漢,430030 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科,武漢,430022)

縫隙連接是細(xì)胞間連接方式的一種,由縫隙連接蛋白 (connexin,Cx)所構(gòu)成。相鄰細(xì)胞間通過(guò)縫隙連接所介導(dǎo)的細(xì)胞縫隙連接通訊 (gapjunction intercellular communication,GJ IC)進(jìn)行著信息和能量物質(zhì)的交換,參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號(hào)傳遞的電偶聯(lián),對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過(guò)程起著重要的調(diào)控作用。Cx廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織,在不同的細(xì)胞、組織和種族中有不同的表達(dá)。其中,Cx43是Cx家族中分布最廣的分子,幾乎對(duì)所有組織細(xì)胞都有調(diào)控作用。Cx43在脂肪細(xì)胞的形成中起重要作用,小干擾RNA使Cx43表達(dá)下調(diào),可抑制脂肪細(xì)胞的形成[1]。在高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型均可見(jiàn)Cx43表達(dá)上調(diào),其升高的機(jī)制與高脂血癥、機(jī)械損傷和炎癥反應(yīng)有關(guān),降低Cx43表達(dá)可減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[2,3,4,]。但也有報(bào)道喂飼富含膽固醇的飲食引起的高膽固醇血癥會(huì)導(dǎo)致心肌Cx43蛋白表達(dá)下調(diào),從而抑制心肌的收縮功能[5]。表明 GJ IC和Cx43與脂肪代謝有關(guān)系,但限制性高脂飲食 (脂肪含量高,熱量攝入與對(duì)照一致)對(duì)Cx43表達(dá)的影響,目前未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予動(dòng)物高脂飲食,但控制其熱量攝入量與普通飼料一致,來(lái)初步探索限制性高脂飲食對(duì)Cx43表達(dá)的影響。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選1個(gè)月左右健康Wistar大鼠54只 (由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重120±10 g,雌雄各半,在18-21℃環(huán)境溫度與80%的濕度自由飲水的條件下飼養(yǎng)7d后,隨機(jī)選取雌雄20只為普通飼料喂養(yǎng)組 (雌.雄各半),16只為限制性高脂飼料喂養(yǎng)組 (雌、雄各半),平均體重為150.30±5.40g。

2.限制性高脂飲食配方 普通基礎(chǔ)飼料由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供,每100g飼料總能量為1451.2 kJ,每天每100g大鼠的平均喂飼量為10g。高能高脂飼料按100 g基礎(chǔ)飼料,加酪蛋白10g、豬油 38.63g、淀粉 39.63g、KCl 1.01g、NaCl 1.25g、MgCl21.09g、混合維生素 (21世紀(jì)金施爾康-混合維生素,上海強(qiáng)生制藥廠)1.0g、豆油8.0g的比例配置,每100g飼料總能量為2586.5 kJ,每天每100g大鼠的平均喂飼量為6g,喂飼13周。兩種飼料喂養(yǎng)組的熱量攝入基本一致。

3.體重測(cè)量及動(dòng)物處理 各組動(dòng)物每7d測(cè)量并記錄體重1次。動(dòng)物喂飼13周后,測(cè)量體重和體長(zhǎng)后,計(jì)算Lee’s指數(shù)= [體重 (g) ·1000]3體長(zhǎng) (cm)。然后分別處死采集心臟血2ml,離心1 500 r/min×5 min,收集血漿測(cè)定血糖與血脂水平,并分別取出腦、心、肝、胰、腎、睪丸組織用中性甲醛溶液固定,石蠟包埋。

4.血糖與血脂水平的檢測(cè) 血漿葡萄糖濃度的檢測(cè)采用葡萄糖液體試劑盒 (己糖激酶法)(德塞診斷系統(tǒng)上海有限公司),操作步驟:將“試劑1”4份加“試劑2”1份混合成單試劑,10μl樣品/空白對(duì)照/標(biāo)準(zhǔn)品加入1000μl單試劑,37℃反應(yīng)5min,用雅培 AEROSET全自動(dòng)生化分析儀(4000型)檢測(cè),波長(zhǎng)340nm,30min內(nèi)記錄吸光度,儀器直接報(bào)告結(jié)果,結(jié)果以mmol/L表示。血漿總膽固醇的檢測(cè)采用總膽固醇液體試劑盒 (酶試劑法)(德塞診斷系統(tǒng)上海有限公司),操作步驟:10μl樣品/空白對(duì)照/標(biāo)準(zhǔn)品加入 1000μl試劑,37℃反應(yīng)10min,用雅培AEROSET全自動(dòng)生化分析儀 (4000型)檢測(cè),波長(zhǎng)500nm,60min內(nèi)記錄吸光度,儀器直接報(bào)告結(jié)果,結(jié)果以mmol/L表示。甘油三酯液體試劑盒 (酶試劑法)(德塞診斷系統(tǒng)上海有限公司),操作步驟:10μl樣品/空白對(duì)照/標(biāo)準(zhǔn)品加入 1000μl試劑,37℃反應(yīng)10min,用雅培 AEROSET全自動(dòng)生化分析儀(4000型)檢測(cè),波長(zhǎng)500nm,記錄吸光度,儀器直接報(bào)告結(jié)果,結(jié)果以mmol/L表示。

5.HE染色 取石蠟切片,60℃烤2h,二甲苯脫蠟,酒精梯度脫水后,常規(guī) HE染色。

6.免疫組化染色及圖像分析 取石蠟切片,60℃烤2h,二甲苯脫蠟,酒精梯度脫水,PBS洗,3min×3次;0.3%TritonX-100室溫孵育20min;3%H2O2室溫孵育15min,以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;10%山羊血清封閉,室溫30min;甩去多余液體,不洗;加入1:100稀釋的兔抗鼠connexin-43親和純化多克隆抗體 (Santa Cruz,USA),4℃過(guò)夜,0.01mol/L PBS洗5min×3次;滴加生物素化羊抗兔 IgG,37℃45min;0.01mol/L PBS洗5min×3次;滴加 SAB試劑,37℃20min;0.01mol/L PBS洗5min×4次;DAB顯色,蒸餾水洗滌;蘇木素輕度復(fù)染,脫水、透明、封片;用Image pro-plus顯微圖像分析系統(tǒng)分析Cx43的陽(yáng)性顆粒的平均光密度反應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示,兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗(yàn),以 P<0.05為有顯著性差異。

結(jié) 果

1.限 制性高脂飼料喂養(yǎng)組與普通飼料喂養(yǎng)組大鼠體重及Lee’s指數(shù)

大鼠體重及Lee’s指數(shù)

大鼠分別用限制性高脂飼料和普通飼料飼喂13周后,測(cè)量大鼠體重及Lee’s指數(shù),結(jié)果顯示,雌性和雄性限制性高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠體重及Lee’s指數(shù)與普通飼料喂養(yǎng)組差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)(見(jiàn)圖 1)。

圖1 限制性高脂飼料喂養(yǎng)組與普通飼料喂養(yǎng)組大鼠體重及 Lee′s指數(shù)Fig.1 Body weight and Lee′s index in restricted high fat feeding and control groups.

2.限 制性高脂飼料喂養(yǎng)組與普通飼料喂養(yǎng)組大鼠血脂、血糖水平

分別用限制性高脂飲食和普通飼料飼喂13周后,抽血檢測(cè)血漿總膽固醇、甘油三脂和葡萄糖水平,結(jié)果顯示,雌性和雄性限制性高脂飼料喂養(yǎng)組與普通飼料喂養(yǎng)組差異無(wú)顯著性意義 (P>0.05)(見(jiàn)圖 2)。

圖2 限制性高脂飼料喂養(yǎng)組與普通飼料喂養(yǎng)組大鼠血漿總膽固醇、甘油三脂和葡萄糖水平Fig.2 Plasma glucose,total cholesterol and triglyceride in restricted high fat feeding and control groups.

3.限 制性高脂飲食大鼠腦、肝臟、腎臟、胰島及睪丸Cx43蛋白的表達(dá)

3.1 腦Cx43蛋白的表達(dá)

在大鼠大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元細(xì)胞中,雌性普通飼料組大腦皮質(zhì)未發(fā)現(xiàn)有Cx43蛋白表達(dá),雌性限制性高脂飼料組大腦皮質(zhì)部分神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中及突起可見(jiàn)有明顯表達(dá),二者有顯著性差異 (P<0.01);而雄性普通飼料組和限制性高脂飼料組大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中都有Cx43散在表達(dá),兩組間無(wú)顯著性差異 (P<0.01)(圖3,表1)。

在大鼠海馬區(qū)域的神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿、樹(shù)突、軸突中都有Cx43表達(dá),雌雄大鼠限制性高脂飼料喂養(yǎng)組均明顯高于普通飼料組 (P<0.01)(圖3,表1)。

3.2 肝臟Cx43蛋白表達(dá)

Cx43在大鼠肝門(mén)管區(qū)周?chē)渭?xì)胞胞漿中散在表達(dá),雌性大鼠限制性高脂飼料喂養(yǎng)組明顯高于普通飼料組 (P<0.01);雄性正好相反,限制性高脂飼料喂養(yǎng)組明顯低于普通飼料組 (P<0.01);而且雄性普通飼料組的表達(dá)明顯高于雌性 (P<0.01)(圖 3, 表 1)。

在肝中央靜脈周?chē)母渭?xì)胞中Cx43散在表達(dá),雌性大鼠限制性高脂飼料喂養(yǎng)組明顯高于普通飼料組 (P<0.01),雄性正好相反,限制性高脂飼料喂養(yǎng)組明顯低于普通飼料組 (P<0.01);而且雄性普通飼料組的表達(dá)明顯高于雌性 (P<0.01)(圖 3, 表 1)。

3.3 腎臟Cx43蛋白的表達(dá)

Cx43在大鼠腎皮質(zhì)近球小管上皮細(xì)胞胞漿中散在表達(dá),雌雄大鼠限制性高脂飼料喂養(yǎng)組均明顯高于普通飼料組 (P<0.01),而且雄性普通飼料組的表達(dá)明顯高于雌性 (P<0.01)(圖3,表1)。

在髓袢粗段腎小管上皮細(xì)胞,Cx43呈現(xiàn)彌散表達(dá),雌性大鼠限制性高脂飼料喂養(yǎng)組明顯高于普通飼料組 (P<0.01),雄性正好相反,限制性高脂飼料喂養(yǎng)組明顯低于普通飼料組 (P<0.01)(圖3,表1)。

3.4 胰島Cx43蛋白表達(dá)

Cx43在胰島細(xì)胞有表達(dá),雌性大鼠限制性高脂飼料喂養(yǎng)組明顯低于普通飼料組 (P<0.05),雄性正好相反,限制性高脂飼料喂養(yǎng)組明顯高于普通飼料組 (P<0.05);而且雌性普通飼料組的表達(dá)明顯高于雄性 (P<0.01)(圖3,表1)。

3.5 睪丸Cx43蛋白的表達(dá)變化

Cx43在雄性大鼠睪丸生精小管間質(zhì)細(xì)胞中散在表達(dá),限制性高脂飼料喂養(yǎng)組明顯高于普通飼料組 (P<0.05)(圖 3,表 1)。

表1 限制性高脂飼料喂養(yǎng)大鼠各器官的Cx43蛋白表達(dá)Table 1 Cx43 protein expression of restricted high fat feeding rats in some organs

討 論

研究給大鼠喂飼高脂飼料,但控制高脂飼料的攝入量,使之與普通飼料組平均攝入熱量一致,結(jié)果喂飼13周后,大鼠的體重和Lee’s指數(shù)與對(duì)照無(wú)明顯差異,說(shuō)明沒(méi)有導(dǎo)致肥胖,血漿總膽固醇、血漿甘油三酯和血糖水平也與對(duì)照一致,說(shuō)明沒(méi)有引起高血糖和高血脂,因此限制性高脂飲食的大鼠模型復(fù)制成功[6]。

Cx43是Cx家族中分布最廣的分子,幾乎對(duì)所有組織細(xì)胞都有調(diào)控作用。Cx43是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接的主要成分,在神經(jīng)元的形成、遷移中發(fā)揮重要作用。Cx43的表達(dá)減少可減弱神經(jīng)元的生長(zhǎng)。Cx43基因敲除的小鼠,顯示運(yùn)動(dòng)能力的改變,腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化,腦缺血后凋亡和炎癥增加,對(duì)缺氧預(yù)適應(yīng)不敏感[7,8]。Cx43在肝臟主要表達(dá)于肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,如 Kupffer’s細(xì)胞,膽管上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等[9,10],與細(xì)胞的生長(zhǎng)控制有關(guān),生長(zhǎng)因子或促瘤劑處理會(huì)導(dǎo)致縫隙連接蛋白表達(dá)降低[11]。在腎臟的研究顯示,ATP去除導(dǎo)致的縫隙連接半通道的活化介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的損傷[12]。Cx43是胰島素分泌細(xì)胞之間連接通道的主要成分,刺激胰島B細(xì)胞分泌的因素同時(shí)可導(dǎo)致Cx43表達(dá)增加[13,14]。 縫隙連接在精子生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在血-睪屏障中,Cx43和橋粒蛋白plakophilin-2(PKP2)形成蛋白復(fù)合物調(diào)節(jié)血-睪屏障的細(xì)胞黏附,有利于原始精母細(xì)胞的通過(guò)[15,16,17]。

研究檢測(cè)了Cx43蛋白在上述器官的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Cx43蛋白的表達(dá)存在明顯的性別差異,在肝門(mén)管區(qū)和中央靜脈周?chē)湍I臟近球小管上皮細(xì)胞,雄性普通飼料組Cx43的表達(dá)明顯高于雌性,而胰島細(xì)胞則是雌性高于雄性。以上結(jié)果提示,性別影響了大鼠體內(nèi)某些器官Cx43的表達(dá)。據(jù)報(bào)道Cx43的表達(dá)受性激素雌二醇和睪酮的調(diào)節(jié)[18]。但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。研究結(jié)果顯示,在雌性大鼠中,上述器官除胰島外,均是限制性高脂飼料組的Cx43表達(dá)量強(qiáng)于普通飼料組;在雄性大鼠中,則觀察到海馬區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞和腎近球小管上皮細(xì)胞及胰島細(xì)胞的Cx43表達(dá)是限制性高脂飼料組強(qiáng)于普通飼料組,而在肝門(mén)管區(qū)、肝中央靜脈周?chē)母渭?xì)胞和髓袢粗段腎小管上皮細(xì)胞Cx43表達(dá)是限制性高脂飼料組弱于普通飼料組。以上結(jié)果提示,限制性高脂飲食可影響大鼠某些器官Cx43的表達(dá),有性別差異。

研究結(jié)果顯示限制性高脂飲食喂養(yǎng)大鼠,由于控制了其飼料攝入量,因而其體重、Lee’s指數(shù)、血糖、血脂水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異,但Cx43的表達(dá)在不同器官出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào),提示限制性高脂飲食引起的Cx43表達(dá)變化可能是多種機(jī)制的綜合作用。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致Cx43表達(dá)上調(diào)的重要機(jī)制,有報(bào)道在肝 Kupffer’s細(xì)胞和腦星形膠質(zhì)細(xì)胞,炎癥因子可引起Cx43表達(dá)上調(diào)[9,19]。限制性高脂飲食也可能是由于飲食結(jié)構(gòu)的改變而影響代謝相關(guān)激素如胰島素、腎上腺髓質(zhì)素等的分泌而影響Cx43的表達(dá)[20,6]。

研究結(jié)果表明,限制性高脂飲食可以改變大鼠體內(nèi)某些器官的Cx43的表達(dá),從而影響器官功能。該研究可能為某些疾病的發(fā)病機(jī)制的闡明和防治提供新思路。

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圖3 限制性高脂飼料喂養(yǎng)大鼠各器官Cx43蛋白的表達(dá) (免疫組織化學(xué)染色,棕色為陽(yáng)性顆粒,標(biāo)尺=50μm)Fig.3 Cx43 protein expressionin some organs in female and male restricted high fat feeding and control rats(Immunohistochemistry staining,Bar=50μm)

圖3 限制性高脂飼料喂養(yǎng)大鼠各器官Cx43蛋白的表達(dá) (免疫組織化學(xué)染色,棕色為陽(yáng)性顆粒,標(biāo)尺=50μm)Fig.3 Cx43 protein expressionin some organs in female and male restricted high fat feeding and control rats(Immunohistochemistry staining,Bar=50μm)