劉發(fā)強(qiáng)，遲大民，蘇立強(qiáng)，王 穎

（齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

分子印跡技術(shù)是近年來集高分子合成、分子設(shè)計(jì)、分子識別、仿生生物工程等眾多學(xué)科優(yōu)勢發(fā)展起來的一門邊緣學(xué)科分支。分子印跡聚合物由于具有與天然抗體相似的識別選擇性和高分子材料的抗腐蝕性能的雙重優(yōu)點(diǎn)，因而正逐步應(yīng)用于分析化學(xué)、生物工程、臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品工業(yè)等眾多領(lǐng)域。在固相提取、藥物的手性分離[1]、傳感器等方面展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景。

乙胺嘧啶[2]是一種廣譜抗菌獸藥，主要用于防治雞球蟲病、禽霍亂及仔豬白痢等。乙胺嘧啶在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上也有著廣泛的應(yīng)用，適量使用能增強(qiáng)水產(chǎn)動物的抗病能力，但是乙胺嘧啶在水產(chǎn)品體內(nèi)具有高度的蓄積性，超出一定范圍，人食用后破壞人的造血系統(tǒng)，造成溶血性貧血癥，甚至有引起潛在致癌性的可能，同時對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有直接的毒性作用。敵菌凈屬于二氨基嘧啶類藥物，是一種抗菌增效劑，主要與乙胺嘧啶和磺胺類藥物等抗生素組成復(fù)方制劑，抗菌活性增強(qiáng)，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用十分廣泛。因此，在動物產(chǎn)品和水產(chǎn)品體內(nèi)會同時殘留乙胺嘧啶和敵菌凈[3]，針對乙胺嘧啶有致癌的可能性和對神經(jīng)中樞的毒害作用將乙胺嘧啶與敵菌凈進(jìn)行分離是十分重要的[4]。

本文采用分子印跡技術(shù)，以乙胺嘧啶為模板分子，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，在苯甲醇和乙腈的混合溶液中制備了乙胺嘧啶分子印跡聚合物。把制得的乙胺嘧啶分子印跡聚合物用于液相色譜固定相，在甲醇水為流動相中可將其與結(jié)構(gòu)類似物敵菌凈基線分離，吸附實(shí)驗(yàn)中印跡聚合物對乙胺嘧啶有特異的吸附性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（UV230+紫外可變波長檢測器，P230高壓恒流泵）；Echrom2000色譜工作站（大連依利特分析儀器有限公司）；TU-1901型雙波長紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（北京泰克儀器有限公司）。

乙胺嘧啶和敵菌凈（純度＞98%，武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（A.R.東京化成工業(yè)株式會社）；偶氮二異丁睛（A.R.北京化工廠）；甲基丙烯酸（A.R.北京化工廠）。

1.2 聚合物的制備

稱取模板分子乙胺嘧啶0.2487g（1mmol），將其溶于10mL苯甲醇和5mL乙腈混合溶液中，再加入功能單體甲基丙烯酸0.35g（4mmol），加入交聯(lián)劑EDMA 4.0g（20mmol），引發(fā)劑 AIBN 0.05g，超聲震蕩后將其轉(zhuǎn)入安培管中，反復(fù)抽真空脫氧，充N23～5次，最后在N2保護(hù)下抽真空封管。采用熱引發(fā)方式聚合，將安培管放入60℃恒溫水浴中，反應(yīng)48h后取出，將得到的聚合物經(jīng)過粗研，用索式提取器提取24h，提取液為苯甲醇/乙酸體積比為9∶1，以除去模板分子。將洗脫完的聚合物過300目分樣篩，用丙酮反復(fù)沉降，移出清液，把剩余固體放在通風(fēng)櫥內(nèi)自然晾干，以備使用。

制備非印跡聚合物NMIP時，除不加模板分子和無需進(jìn)行索氏提取以外，其它步驟同上。

1.3 色譜條件

色譜柱：20 cm×4.6 mm i d；檢測波長為235 nm；流速為1.0 mL·min-1；流動相為甲醇：水（0.6%冰乙酸）=25:75；進(jìn)樣量 10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制一系列濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg·mL-1的乙胺嘧啶甲醇溶液，用高效液相色譜進(jìn)行檢測。繪制乙胺嘧啶濃度與色譜峰面積值的工作曲線如圖1，回歸方程式為y=363.69x+33.702，線性相關(guān)系數(shù)0.9996。由圖1可見，乙胺嘧啶濃度在0.1～0.9 mg·mL-1范圍內(nèi)，兩者之間有良好的線性關(guān)系。

圖1 乙胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of pyrimethamine

2.2 MIP對乙胺嘧啶的吸附作用及選擇性研究

采用靜態(tài)吸附法考察所制備的MIPs吸附性能。配制一系列濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg·mL-1的乙胺嘧啶甲醇溶液各 10 mL，分別投入50mg乙胺嘧啶分子印跡聚合物，靜置過夜。用高效液相色譜測量其峰面積A，依據(jù)工作曲線計(jì)算出不同峰面積所對應(yīng)底物的平衡濃度。

根據(jù)結(jié)合前后溶液中底物濃度的變化，由方程Q=（Co-Ce）V/W計(jì)算出聚合物對底物的吸附量Q（mg·g-1），繪出吸附量Q與不同濃度關(guān)系的動力學(xué)曲線。其中：Co：乙胺嘧啶溶液的初始濃度；Ce：吸附后的濃度；V：加入乙胺嘧啶溶液的體積；W：稱取的分子印跡聚合物的質(zhì)量。

圖2 MIP和NMIP的吸附量Fig.2 Adsorbance of MIP and NMIP

由圖2可以看出，印跡聚合物對乙胺嘧啶具有特異性吸附。對比二種聚合物的合成過程，可以得出印跡聚合物對乙胺嘧啶具有特異性吸附的原因是，在合成過程中由于乙胺嘧啶的加入而形成了復(fù)合物，當(dāng)洗滌出模板物質(zhì)后在聚合物內(nèi)部形成了形狀與官能團(tuán)位置均與乙胺嘧啶相配合的空腔，正是由于這些空腔的存在，使印跡聚合物對模板物質(zhì)具有良好的選擇性結(jié)合能力。雖然NMIP和乙胺嘧啶也形成氫鍵，但由于位置關(guān)系，不具有作用位點(diǎn)的匹配，阻礙同其它分子的作用，因此，對乙胺嘧啶的吸附很小，而MIP對乙胺嘧啶確有特異的吸附性。

2.3 流動相的選擇

分離實(shí)驗(yàn)流動相采用甲醇水體系，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，改變流動相中水的含量，將引起分離度的變化，采用甲醇/水為25∶75，達(dá)到基線分離。這是因?yàn)楫?dāng)流動相中有機(jī)相含量占主要的時候，氫鍵占主要地位，水的加入導(dǎo)致了聚合物與模板氫鍵強(qiáng)度的減弱，隨著有機(jī)相中水含量的增加，氫鍵越來越弱，模板與聚合物的離子鍵和疏水作用此時卻變得越來越強(qiáng)，分子識別逐步由氫鍵識別機(jī)理轉(zhuǎn)化為離子交換機(jī)理和疏水作用所控制。在實(shí)驗(yàn)的過程中常出現(xiàn)基線漂移現(xiàn)象，在流動相中加入0.6%的冰乙酸能夠很好的解決這個問題。本文在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過程中加入冰乙酸的含量為0.05%～0.80%，含量較低時仍出現(xiàn)基線漂移現(xiàn)象，含量較高時基線漂移現(xiàn)象消失但是分離度下降，這是因?yàn)楸宜岷窟^高破壞分子間氫鍵，分子識別作用變?nèi)?。?shí)驗(yàn)證明冰乙酸的含量為0.6%時，能更好的防止基線漂移和雜質(zhì)離子干擾。

綜上所述,乙胺嘧啶和敵菌凈的分離實(shí)驗(yàn)流動相采用甲醇/水/冰乙酸為25∶75∶0.6%。

2.4 聚合物對模板分子及結(jié)構(gòu)類似物的色譜分離

以聚合物作為色譜固定相，制成色譜柱。利用高效液相色譜法對乙胺嘧啶和結(jié)構(gòu)類似物敵菌凈（結(jié)構(gòu)見圖3）混合溶液進(jìn)行檢測，見圖4、5。

圖3 乙胺嘧啶與敵菌凈的結(jié)構(gòu)式Fig.3 Molecular graph of pyrimethamine and diaveridine.

圖4 空白聚合物色譜評價(jià)圖Fig.4 Chromatographic evaluation chart of NMIP

從圖4中可以看出，在非印跡柱上，兩種物質(zhì)均無保留，并且色譜峰完全重疊。

圖5 印跡聚合物色譜評價(jià)圖Fig.5 Chromatographic evaluation chart of MIP

從圖5中可以看出，在印跡柱上，二者出峰時間均加長了，并且乙胺嘧啶的出峰時間比敵菌凈的出峰時間長，乙胺嘧啶的峰有拖尾，這正是烙印型色譜固定相分離的典型特征。二者達(dá)到了基線分離，說明所制備的乙胺嘧啶印跡聚合物能夠產(chǎn)生很好的孔穴，并且這種孔穴與模板分子的專一匹配程度很好，因此，它能夠達(dá)到對于乙胺嘧啶與其結(jié)構(gòu)相似物（敵菌凈）的分離。

3 結(jié)論

以乙胺嘧啶為模板分子，在苯甲醇和乙腈混合溶液中制備了乙胺嘧啶分子印跡聚合物，可以識別模板分子及其類似物，對乙胺嘧啶呈現(xiàn)了很高的選擇性。以甲醇水為流動相，色譜分離乙胺嘧啶和敵菌凈達(dá)到基線分離。繪制不同濃度的吸附量曲線，結(jié)果表明印跡聚合物遠(yuǎn)大于非印跡聚合物的吸附量，說明印跡聚合物對乙胺嘧啶有特異的吸附性。

［1］郭天瑛,張麗影,郝廣杰.氨基酸衍生物手性分離分子印跡聚合物［J］.化學(xué)進(jìn)展,2004,16（4）:638-642.

［2］錢桂平,余建中.高效液相色譜法測定魚肉中的乙胺嘧啶［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15（6）:697-698.

［3］林海丹,林峰.高效液相色譜法測定動物源性食品中甲氧芐胺嘧啶藥物殘留［J］.檢驗(yàn)檢疫學(xué),2003,13（5）:5-6.

［4］吳小平,鄒世平,李曉莉，等.鰻鱺血漿與肌肉中乙胺嘧啶檢測方法的建立［J］.淡水漁業(yè),2007,37（4）:65-68.