王偉敏 綜述 徐 泱 樊 嘉, 審校

(1.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,上海 200032;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所,上海 200032)

Notch基因發(fā)現(xiàn)于1919年,它的缺失可導(dǎo)致果蠅翅緣缺刻[1]。隨后研究發(fā)現(xiàn),Notch在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的多個(gè)物種中均有表達(dá),它不僅在許多器官及細(xì)胞的正常發(fā)育中起作用,還與一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。自Notch在人類(lèi)T淋巴母細(xì)胞白血病中首先被鑒定以來(lái)[2],在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有Notch信號(hào)通路的異常激活。現(xiàn)就Notch信號(hào)通路在肝癌中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 Notch信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路(notch signaling,以下簡(jiǎn)稱(chēng)NS)是由 Notch受體、配體、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子、調(diào)節(jié)分子及其他的效應(yīng)物等組成。N-S主要通過(guò)旁側(cè)抑制介導(dǎo)對(duì)多種不成熟細(xì)胞分化的抑制信號(hào)[3]。

1.1 參與N-S的主要分子 (1)Notch受體:Notch蛋白是由其基因編碼的單鏈跨膜受體蛋白,分子量約300 kD,由2 753個(gè)氨酸殘基組成,其基本結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)(ECN)、跨膜區(qū)(TM)和胞內(nèi)區(qū)(ICN)。脊椎動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)了4個(gè)Notch同源體,分別編碼4種Notch受體(Notch1-4)。(2)配體:可結(jié)合并激活Notch受體;人的Notch同源配體有兩類(lèi):Delta樣配體(Dll1、Dll3、Dll4)和 Serrate樣配體(Jag1、Jag2)。(3)細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子:一方面與ICN的RAM結(jié)構(gòu)域結(jié)合,形成ICN-CSL復(fù)合物;另一方面可與核內(nèi)特定的DNA序列結(jié)合,激活轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

1.2 Notch的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和激活方式及調(diào)節(jié) 目前廣泛認(rèn)可的是Notch3步裂解法[4]:Notch在furin樣轉(zhuǎn)化酶的作用下于S1位點(diǎn)發(fā)生裂解,產(chǎn)生的胞外區(qū)和跨膜區(qū)以二硫鍵相接而形成 Notch受體。當(dāng)其與配體結(jié)合后,在腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)化酶作用下,Notch在S2位點(diǎn)裂解為2個(gè)片段。C端裂解產(chǎn)物進(jìn)一步在跨膜區(qū)S3位點(diǎn)發(fā)生裂變,經(jīng)γ-分泌酶水解釋放的ICN進(jìn)入核內(nèi),其RAM區(qū)與CSL蛋白和MAML蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,再募集轉(zhuǎn)錄輔助激活因子PCAF及P300等,激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。

Notch受體與配體結(jié)合后,可直接轉(zhuǎn)至核內(nèi)(放大效率低、特異性強(qiáng));但多種配體共同存在,激活N-S可引發(fā)多種信號(hào)、多種調(diào)節(jié)因素通過(guò)不同機(jī)制調(diào)節(jié)Notch信號(hào)。

2 N-S和肝臟發(fā)育與再生

多種研究[5-7]顯示:N-S在肝內(nèi)膽管形成、血管發(fā)育中起重要作用。表達(dá)在胚胎膽管板上的Jag1與肝門(mén)束旁的間充質(zhì)和肝動(dòng)脈內(nèi)皮上的Notch3間的相互作用,對(duì)人胎肝膽管板重塑和肝內(nèi)膽系發(fā)育起作用[5]。在Alagille綜合征患者,Jag1基因突變使肝內(nèi)膽管發(fā)育缺陷;用AlbCre轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步研究[6]發(fā)現(xiàn)Notch2缺失引起肝膽管板結(jié)構(gòu)異常、肝內(nèi)膽管結(jié)構(gòu)混亂且伴有肝門(mén)區(qū)炎性纖維化和肝細(xì)胞羽毛狀變性;其缺失程度與與肝內(nèi)膽管異常情況呈正相關(guān)。同時(shí),研究Jag1/Notch2雙雜合子Alagille綜合征模型和肝特異性Notch2缺失模型,也發(fā)現(xiàn)Notch功能缺失突變小鼠的膽管形態(tài)形成缺陷[7]。

Fabris等[8]研究N-S在肝臟修復(fù)中的作用,發(fā)現(xiàn)其缺乏導(dǎo)致活性膽管細(xì)胞缺失和缺少肝臟核因子的肝膽管細(xì)胞堆積,最終不能轉(zhuǎn)化為膽道表型而影響肝膽管再形成。Croquelois等[9]用Notch1基因敲除小鼠模型來(lái)研究N-S在肝細(xì)胞增殖分化中的作用,發(fā)現(xiàn)Notch1缺失導(dǎo)致肝細(xì)胞持續(xù)增殖,而發(fā)展為結(jié)節(jié)性再生性增生;Notch信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞再生和增殖。

值得注意的是,肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)對(duì)剩余肝的肝細(xì)胞有支持作用,從肝再生到再生肝實(shí)質(zhì)血管形成,都必須有LSECs的增殖。而Notch/RBP-J信號(hào)通路對(duì)LSECs起雙重作用:抑制剩余肝增殖;促進(jìn)再生肝增殖和功能分化[10]。N-S對(duì)肝細(xì)胞的確切作用及其機(jī)制尚未明確,尚需深入研究。

3 N-S和慢性肝炎、肝硬化、肝癌

Notch和 TGF-β協(xié)同調(diào)節(jié)Foxp3表達(dá)和維持Treg細(xì)胞,γ-分泌酶抑制劑(GSI)可抑制由Notch1、CSL和Smad結(jié)合體維持的Foxp3啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn);活體內(nèi)給予GSI使Foxp3表達(dá)減少并產(chǎn)生自身免疫性肝炎癥狀[11]。在肝硬化中,發(fā)現(xiàn)Notch和 Toll樣受體信號(hào)通路的表達(dá)失調(diào)[12]。Gramantieri等[13]以癌旁組織為對(duì)照,分析Notch及靶基因在肝細(xì)胞肝癌(HCC)中表達(dá)情況:HCC組織中有Notch3和Notch4的異常增多;Notch3、Notch4在正常肝和癌旁慢性肝炎區(qū)不表達(dá),Notch3在肝硬化組織為陰性,HES6 mRNA和 Notch3 mRNA在肝硬化中表達(dá)量比 HCC組織中少;Hep G2細(xì)胞系高表達(dá)Notch3,低表達(dá)Notch4及其mRNA。與HCV-4感染相關(guān)的埃及 HCC患者的c-DNA芯片顯示[14]:伴有與不伴有肝硬化的HCC有22個(gè)基因差異性表達(dá),Notch4與HCC中高表達(dá)的基因相關(guān)。Gao等[15]把肝細(xì)胞癌組織的贅生性細(xì)胞與癌旁組織相比,前者胞質(zhì)中Notch1和胞核中Notch4高表達(dá),Notch2低表達(dá),胞核中Notch1、胞質(zhì)中Notch4及Notch3表達(dá)未見(jiàn)異同。由此可見(jiàn),Notch受體在HCC組織中表達(dá)較混亂。

多項(xiàng)研究[13,16-17]表明,N-S抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 Notch的 SMMCICD7721細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),p21、p53高表達(dá),JNK信號(hào)活性增強(qiáng),周期蛋白、CDK2、磷酸化Rb表達(dá)降低,Bcl-2不表達(dá),提示N-S作用于細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路起到上述作用[13]。同樣,Qi等[16]用攜帶Notch ICN基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染SMMC7721,表達(dá)Notch1 ICN的肝癌細(xì)胞停滯于G0/G1期,并誘導(dǎo)肝癌周期蛋白減少,而p21高表達(dá),說(shuō)明Notch1能誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡。Western blot還顯示p53表達(dá)增高,Bcl-2、P-JNK非磷酸化的JNK表達(dá)減少,N-S誘導(dǎo)凋亡可能與蛋白磷酸激酶途徑相關(guān)[16]。把肝癌組織塊接種到Notch受體轉(zhuǎn)錄因子RBP-J失活的小鼠體內(nèi),腫塊生長(zhǎng)減慢,新生血管形成增加、灌流量減少,但轉(zhuǎn)移性增加[17]。同時(shí)有研究[12,18-22]顯示,N-S促進(jìn)肝癌的發(fā)生和進(jìn)展。利用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR和 Western blot分析發(fā)現(xiàn),Notch-1和HES-1在肝癌組織中高表達(dá);Notch高表達(dá),HuH-7的增殖、侵襲能力增強(qiáng)[18];Jag1在肝癌中表達(dá)明顯升高,與HBx相互作用可能是肝癌發(fā)生的原因之一[19]。Dll1在肝癌組織中表達(dá)量高,并且Dll1表達(dá)升高量與肝癌的增殖能力正相關(guān)[20]。N-S還促進(jìn)HepG2細(xì)胞系增殖,通過(guò)GSI抑制N-S后,腫瘤細(xì)胞的增殖也受到抑制[21]。Wurmbach等[12]發(fā)現(xiàn)晚期肝癌階段與DNA復(fù)制、修復(fù)和細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào),而N-S在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展中有重要作用[22],至于N-S是否參與了肝癌進(jìn)展尚需確證。

4 N-S和干細(xì)胞

就N-S一般作用而言,Wilson等[23]稱(chēng)其為干細(xì)胞的“門(mén)衛(wèi)”。它影響著細(xì)胞的命運(yùn),誘導(dǎo)無(wú)脊椎動(dòng)物的終末分化進(jìn)程和哺乳動(dòng)物器官系統(tǒng)的自我更新。但“肝癌干細(xì)胞”的確切起源、分子遺傳學(xué)和HCC高侵襲機(jī)制等,還處于早期探索階段。Notch與 TGF-β、Wnt、Shh等信號(hào)通路間的相互作用參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生[24]?，F(xiàn)就N-S與干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。

4.1 N-S和干細(xì)胞 N-S在干細(xì)胞更新和分化中起重要作用,它促進(jìn)干細(xì)胞自我更新和祖細(xì)胞增殖[25]。HES1是N-S的靶基因,整合基因組分析顯示[26]:HES1主要表達(dá)在未分化的胚胎干細(xì)胞、胚胎組織、再生肝、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤組織中。Notch3基因在富含干/祖細(xì)胞的人乳腺球型培養(yǎng)中高度表達(dá)[27]。在未分化組織中,Notch及靶基因高表達(dá)提示其與干/祖細(xì)胞未分化狀態(tài)高度相關(guān)。

觀察小鼠胚胎定向造血干細(xì)胞集落形成,發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞激活Jag1而維持造血干細(xì)胞的未分化和自我更新[28]。N-S還可與其他信號(hào)通路交叉作用維持干細(xì)胞的狀態(tài)。N-S和Wnt信號(hào)通路協(xié)同維持細(xì)胞的未分化/增殖狀態(tài),Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增,而N-S可影響Wnt信號(hào)通路對(duì)干細(xì)胞間隔和分化的維持作用[29]。在某些條件下,N-S與Wnt信號(hào)通路共同維持干細(xì)胞的增殖是某特定細(xì)胞系分化的基礎(chǔ)[30]。N-S參與Hippo信號(hào)通路調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物器官體積并作用于干細(xì)胞成分;Hippo信號(hào)通路的下游成分YAP1在干細(xì)胞中高表達(dá),激活YAP1的小鼠肝臟體積增大;YAP1可激活NS,而后者對(duì)前者有調(diào)節(jié)作用,兩者與干細(xì)胞/祖細(xì)胞、器官體積和腫瘤間有潛在聯(lián)系[31]。

4.2 N-S和腫瘤干細(xì)胞 Styczynski等[32]提出腫瘤干細(xì)胞(CSCs)的假說(shuō),稱(chēng)其是一群轉(zhuǎn)化形式的干細(xì)胞或獲得自我更新成分的祖細(xì)胞。CSCs是腫瘤細(xì)胞自我更新的來(lái)源,決定了腫瘤的生物學(xué)行為(如增殖、擴(kuò)散和對(duì)放化療的反應(yīng)性等)。CSCs一般都有特異性表面標(biāo)志(如抗原、分子和信號(hào)通路等),信號(hào)通路調(diào)節(jié)CSCs自我更新和細(xì)胞命運(yùn)的功能正逐步被闡明。

人促紅細(xì)胞生成素受體的重組體誘導(dǎo)Jag1以Notch依賴(lài)模式增加干細(xì)胞的量和自我更新,而抑制N-S可阻斷這一效應(yīng),這表明其可能維持腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞表型[33]。Dontu等[34]通過(guò)激活或抑制N-S,研究其在人乳腺干/祖細(xì)胞細(xì)胞命運(yùn)中的決定作用,它促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新及早期祖細(xì)胞增殖但不影響完全分化的乳腺上皮細(xì)胞,乳腺癌的發(fā)生可能與異常的N-S對(duì)正常的乳腺干細(xì)胞調(diào)節(jié)異常有關(guān)。磷酸酯酶和張力蛋白同系物(PTEN)參與干細(xì)胞的維持,一旦缺失將導(dǎo)致CSCs發(fā)育而最終致瘤,激活N-S引起PTEN下調(diào)[35],表明 N-S調(diào)節(jié)PTEN對(duì)干細(xì)胞作用。

N-S和Hedgehog-Gli1信號(hào)通路與CSCs的自我更新和致瘤性有關(guān),且可能在放療后CSC再生中起重要作用[36]。與腫塊的分化細(xì)胞相比,腫瘤干細(xì)胞可能對(duì)細(xì)胞毒性藥物和放療引起的凋亡的抵抗性更強(qiáng),其中N-S等信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活與DNA修復(fù)機(jī)制的增加和ABC運(yùn)載體介導(dǎo)的藥物輸出可能在其對(duì)傳統(tǒng)治療方法抵抗中起作用[37]。

5 N-S和微環(huán)境

據(jù)報(bào)道[38-40],N-S調(diào)節(jié)腫瘤血管形成,但其確切作用尚有爭(zhēng)議。N-S抑制腫瘤新生血管過(guò)度增殖,促進(jìn)發(fā)育成熟而改善其功能[39];抑制Dll4介導(dǎo)通路使不成熟血管繁殖而組織灌流量減少,腫瘤生長(zhǎng)受到抑制[38-39]。Dll4轉(zhuǎn)導(dǎo)的荷瘤小鼠與對(duì)照組相比,其形成的血管少而小且缺氧更明顯,血管影像顯示腫瘤供血減少,Dll4的激活減少了腫瘤新生血管形成及血管灌流量而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[40]。Dou等[41]利用 Cre-Lox P介導(dǎo)狀態(tài)的基因缺失小鼠來(lái)研究Notch轉(zhuǎn)錄因子下游區(qū)的RBP-J在維持血管穩(wěn)態(tài)中的作用,結(jié)果顯示RBP-J介導(dǎo)的N-S通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖而維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

Katoh等[42]提出 Wnt-FGF-Notch和 BMPShh信號(hào)通路網(wǎng)間的平衡對(duì)維持干/祖細(xì)胞間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)非常重要,一旦被打破將引起先天性疾病或腫瘤。Notch與部分細(xì)胞或因子相互作用,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲性。在腫瘤微環(huán)境中,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)參與產(chǎn)生脈管系統(tǒng)和間質(zhì)及侵襲性生長(zhǎng)過(guò)程,N-S可限制HGF的活性,負(fù)調(diào)腫瘤侵襲性生長(zhǎng)[43]。組織特異性成纖維細(xì)胞及其產(chǎn)生IL-6,通過(guò)上調(diào)Notch3、Jag1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[44]。

在多種干細(xì)胞/祖細(xì)胞系中,在N-S的參與下,缺氧可維持未分化細(xì)胞的狀態(tài);激活Notch應(yīng)答啟動(dòng)子和增加Notch下游基因的表達(dá),阻斷Notch依賴(lài)的神經(jīng)元和肌原的分化狀態(tài);ICN和HIF-1α間的相互作用和HIF-1α參與N-S的激活都需要低氧環(huán)境[45]。這一現(xiàn)象也為闡明N-S控制細(xì)胞分化和維持干細(xì)胞狀態(tài)的機(jī)制提供了新視角。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述,N-S與肝癌關(guān)系相當(dāng)密切,但其在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中卻有不同甚至相反的作用?？赡茉蛴?成員多類(lèi)型性及其作用多樣性;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多途徑性;與多條信號(hào)途徑間出現(xiàn)“串話”等。只有明確N-S作用,才可以在肝癌的治療中有針對(duì)性地選擇而避免治療的盲目性。GSI通過(guò)抑制N-S而抑制肝癌細(xì)胞系的增殖[22]。可以預(yù)言,以N-S為靶點(diǎn)的腫瘤基因治療及新藥開(kāi)發(fā),將為肝癌治療研究開(kāi)辟新領(lǐng)域。如:就N-S本身而言,可用外源性配體激活或者用拮抗劑抑制N-S;針對(duì)Dll,進(jìn)行腫瘤的抗血管治療;針對(duì)CSCs的特性,進(jìn)行肝癌干細(xì)胞的治療;改變腫瘤干細(xì)胞所處的微環(huán)境而影響其生物學(xué)行為。但前提是必須有方法特異確定“肝癌干細(xì)胞”,從細(xì)胞表面標(biāo)志到干細(xì)胞標(biāo)志以及相關(guān)信號(hào)通路對(duì)其進(jìn)行鑒定的研究尚需探索。

目前,N-S與肝癌的關(guān)系尚待闡明的問(wèn)題還有很多,如N-S在肝癌發(fā)生、發(fā)展的不同環(huán)節(jié)所起的作用及相關(guān)機(jī)制;生理狀態(tài)下與肝癌中的N-S是否相同;改變Notch表達(dá)是否會(huì)對(duì)正常細(xì)胞有不良影響;肝癌干細(xì)胞的確定及其與N-S的聯(lián)系;以及如何開(kāi)展N-S的靶向治療及其臨床意義等。

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