武亮,李建軍,陳亮,遠(yuǎn)麗,逯曉蕾

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后小膠質(zhì)細(xì)胞激活、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes,AS)增殖和膠質(zhì)瘢痕的形成等[1]是阻礙損傷脊髓軸突有效再生和生長(zhǎng)的主要因素。國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后利用藥物治療、體外誘導(dǎo)及基因技術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段,調(diào)控AS中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達(dá),抑制AS的過(guò)度增殖以及阻止瘢痕組織形成,取得了階段性成果。

1 AS的性質(zhì)和功能

1.1 對(duì)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)支持及營(yíng)養(yǎng)作用 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),神經(jīng)元及其突起之間的空隙幾乎全部由AS填充,AS對(duì)神經(jīng)元起結(jié)構(gòu)支持作用;成群的軸突終末終止在一個(gè)神經(jīng)元的某一局部如樹突干時(shí),可被AS的突起包裹,形成突觸小球,與其他神經(jīng)細(xì)胞及其突起分隔[2]。AS又可被看作是一種乳酸貯存細(xì)胞,AS與附近神經(jīng)元一起分享貯存在AS內(nèi)的糖元,在血中谷氨酸缺如時(shí),乳酸可作為神經(jīng)元的能源基礎(chǔ)[3-4]。

1.2 合成和分泌神經(jīng)活性物質(zhì) 正常情況下,AS可低水平合成和分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[5],如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、層黏連蛋白、纖黏連蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子及其他細(xì)胞外基質(zhì)成分,有營(yíng)養(yǎng)和維持神經(jīng)元生存并促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的作用。AS還可分泌多種細(xì)胞因子,如前列腺素、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)家族、趨化因子等,可能與神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞分裂、分化、血細(xì)胞生成調(diào)節(jié)以及免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)有關(guān)[6]。此外,AS還可以合成神經(jīng)活性物質(zhì)如血管緊張素[7]和產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)[8]。

2 AS在脊髓損傷后的病理變化

正常情況下,AS分為靜止態(tài)、活化態(tài)和增殖態(tài),三者相互轉(zhuǎn)換構(gòu)成了廣義上的細(xì)胞周期。在正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,靜止態(tài)和活化態(tài)的膠質(zhì)細(xì)胞并存;當(dāng)受到損傷時(shí),在細(xì)胞因子作用下,靜止態(tài)的細(xì)胞逐漸向活化態(tài)轉(zhuǎn)化?；罨孕切文z質(zhì)細(xì)胞(activated astrocyte,AA)特點(diǎn)是所含的某些脫氫酶的同工酶活性明顯增加,GFAP表達(dá)上調(diào),在形態(tài)上表現(xiàn)為體積增大。在缺血、損傷等刺激下,大量AS快速進(jìn)入活化分裂期,進(jìn)行有絲分裂,最終使其數(shù)目增加、胞體肥大最終交織成網(wǎng)狀,增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)增強(qiáng),5-溴脫氧尿苷(5-BrdU)陽(yáng)性細(xì)胞比率增加[9]。

AS增生活化的因素:①接觸抑制的功能減退[10]:細(xì)胞間的相互接觸使P21蛋白(一種細(xì)胞周期素依賴性酶抑制劑)水平增高,并抑制pRb蛋白(由抑癌基因 Rb表達(dá)可抑制細(xì)胞在 G1/S期的變化)的磷酸化;解除接觸抑制后,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)抑制因素作用減弱,損傷周圍的AS重新進(jìn)入細(xì)胞周期;②損傷部位的AS通過(guò)自分泌、旁分泌細(xì)胞因子促進(jìn)自身的分裂增殖[11]。CNTF、IL-21B刺激AS由靜止態(tài)轉(zhuǎn)化為活化態(tài);TGF-α、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(FGF-2)刺激活化AS進(jìn)入細(xì)胞周期;TGF-β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及干擾素-γ(INF-γ)促進(jìn)反應(yīng)性膠質(zhì)化和膠質(zhì)瘢痕的形成[12];③高分子量的葡萄糖胺聚糖透明質(zhì)酸(HA)可以維持AS的“休眠”狀態(tài),是AS增殖的抑制因素[13];脊髓損傷后,HA降解,對(duì)AS增殖的抑制減弱,其增殖活動(dòng)明顯增強(qiáng);④黏蛋白C對(duì)AS的刺激作用是雙向的:在體外培養(yǎng)的AS中加入黏蛋白C后,AS很少表現(xiàn)為活躍型,表明黏蛋白C能明顯減少體外培養(yǎng)的AS的增值率;但是長(zhǎng)時(shí)間混合黏蛋白 C培養(yǎng)又可以部分刺激其成為活化型[14]。

3 AS在脊髓損傷后的作用

3.1 有利于脊髓損傷修復(fù)方面 AS激活后,其分化的不同時(shí)期對(duì)脊髓損傷修復(fù)起著不同的作用。AS在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期主要是誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的遷移,發(fā)育成熟以后的AS主要是維持神經(jīng)組織形態(tài),同時(shí)其在提供神經(jīng)生長(zhǎng)因子、參與細(xì)胞間的通訊等方面也發(fā)揮重要作用[15]。AS在成熟前(發(fā)育早期),可以分泌二十幾種細(xì)胞因子,以及前列腺素和其他幾種白介素等,對(duì)維持和促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、再生和分化均有重要作用。AS成熟以后可以填充脊髓損傷的缺損區(qū),保持脊髓完整的形態(tài),起到神經(jīng)組織支架的作用?；罨鲋车哪z質(zhì)細(xì)胞以及形成的膠質(zhì)瘢痕,與AS在激活和增殖過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子一起,可將脊髓損傷區(qū)與外界隔離,避免損傷區(qū)受到感染[16]。

3.2 不利于脊髓損傷修復(fù)方面 AS成熟以后,早期具有的多種有益功能逐漸消失,反而分泌有害因子,形成化學(xué)性膠質(zhì)屏障,影響神經(jīng)再生,阻礙軸突延長(zhǎng)[17]。位于脊髓損傷界面內(nèi)成熟的AS顯示有抑制軸突生長(zhǎng)的蛋白聚糖表達(dá)[18-20],并且在瘢痕組織的形成中起主要的作用[21]。膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生和膠質(zhì)瘢痕形成,導(dǎo)致機(jī)械性障礙,影響軸突的再生、延長(zhǎng)和融合[22]。并且膠質(zhì)瘢痕可以形成微血管套,壓迫微血管,影響局部的血液供應(yīng)[23]。由于瘢痕組織缺乏成熟白質(zhì)的線性結(jié)構(gòu),因此需要修復(fù),從而能夠引導(dǎo)軸突長(zhǎng)距離的生長(zhǎng)[24-27]。此外,反應(yīng)性AS還能產(chǎn)生大量的一氧化氮,通過(guò)對(duì)大分子特別是DNA的修飾產(chǎn)生毒性作用,可導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性壞死[28]。

4 抑制AS增殖和瘢痕形成的實(shí)驗(yàn)研究

4.1 藥物

4.1.1 鈣蛋白酶抑制劑 鈣蛋白酶(Calpain)是一種水溶性的鈣依賴性半胱氨酸蛋白質(zhì)。脊髓損傷后,多種結(jié)構(gòu)性蛋白降解增加表明在脊髓損傷病灶中Ca2+依賴性鈣蛋白酶可能被激活[29],使其對(duì)髓磷脂蛋白(MBP、PLP)和細(xì)胞骨架蛋白(NFP、MAP2)產(chǎn)生降解作用。鈣蛋白酶抑制劑MDL2817為疏水性小分子化合物,可通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散作用通過(guò)細(xì)胞膜,能夠阻止鈣蛋白酶Ⅰ激活、AS活化和神經(jīng)元細(xì)胞死亡。在小鼠脊髓橫斷模型的髓鞘內(nèi)注入MDL2817可以改善脊髓損傷的病理過(guò)程,抑制鈣蛋白酶的激活,同時(shí)AS的活化被抑制,膠質(zhì)瘢痕明顯減少[30]。Ray等應(yīng)用鈣蛋白酶特異性抑制劑E-64-d(1 mg/kg)在損傷病灶處進(jìn)行微泵注射,持續(xù)24 h,發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶的活性得到顯著的抑制,反應(yīng)性膠質(zhì)增生的程度減輕[31]。

4.1.2 Olomoucine 細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDK)抑制劑Olomoucine是一種嘌呤衍化物。Olomoucine對(duì)正常靜止態(tài)G0期的AS無(wú)影響,但能作用于處于不同增殖周期的增殖細(xì)胞。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是增殖細(xì)胞(進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞)的標(biāo)志[32],cyclinA、cyclinB1、cyclinE則是細(xì)胞周期中G1/S和G2/M轉(zhuǎn)折點(diǎn)重要的細(xì)胞周期素,可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分裂。Olomoucine干預(yù)可以明顯下調(diào)脊髓損傷組織中cyclinA、cyclinB1、cyclinE和 PCNA的高表達(dá),從而有效抑制AS細(xì)胞的增殖[33]。Olomoucine作用機(jī)制為競(jìng)爭(zhēng)ATP結(jié)合位點(diǎn)來(lái)抑制蛋白激酶活性,導(dǎo)致了CDK1、CDK2及 CDK5等酶活性的降低[34],從而抑制 cyclinE-CDK2、cyclinB-CDK1、cyclinACDK2、brain CDK5-p35復(fù)合物和 ERK1/MAP激酶的活性[35]。這些被抑制的復(fù)合物、激酶能與其底物發(fā)生作用,推動(dòng)細(xì)胞周期繼續(xù)前進(jìn)、啟動(dòng)DNA復(fù)制和有絲分裂。但是,Olomoucine只能選擇性地抑制CDK1、CDK2、CDK5和 ERK1,而對(duì) CDK6的抑制作用較弱,對(duì)CDK4則無(wú)抑制作用[36]。抑制CDK可以使細(xì)胞周期停滯于G1/S和G2/M轉(zhuǎn)折點(diǎn),使細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞分裂受到阻滯,從而抑制了細(xì)胞的分裂增殖。

Olomoucie對(duì)細(xì)胞凋亡的影響是復(fù)雜的,與細(xì)胞的類型、抑制的CDK類型等有關(guān)。研究表明,成年小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,通過(guò)中樞給藥法予以O(shè)lomoucine干預(yù)后,可明顯減少細(xì)胞周期蛋白的增量調(diào)節(jié),抑制AS、小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,減輕胞體肥大[37]。

生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(GAP-43)是神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)發(fā)育和可塑性的分子標(biāo)記物,正常的成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中GAP-43較微弱[38]。研究顯示,脊髓損傷后GAP-43的表達(dá)上調(diào),表明其可能參與了損傷后神經(jīng)生長(zhǎng)修復(fù)的過(guò)程。在給予Olomoucine治療后,GAP-43表達(dá)增高,較損傷對(duì)照組更為明顯,且4周后仍維持在較高水平[33]。

4.1.3 Decorin Decorin是一種細(xì)胞外富含亮氨酸的小分子蛋白多糖[39],于1978年首次被分離純化。其相對(duì)分子質(zhì)量為90×103～140×103,由核心蛋白和一條糖胺聚糖(GAG)鏈構(gòu)成,核心蛋白的80%由富含亮氨酸的24個(gè)氨基酸的重復(fù)單位組成,其核心蛋白相對(duì)分子量約為40×103,以 10～12個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?屬于小分子間質(zhì)性蛋白多糖家族成員。Decorin的結(jié)構(gòu)有其共同的特征,即N末端存在氨基聚糖附著點(diǎn),并緊鄰富含半胱氨酸區(qū)域,數(shù)個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列,C末端存在保守的二硫環(huán)。Decorin廣泛分布在所有哺乳動(dòng)物組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中,GAG鏈的組成隨組織來(lái)源不同而不同,在皮膚組織中為硫酸皮膚素,而在骨和軟骨中為硫酸軟骨素。Decorin基因在人類基因組為雙拷貝,位于 12q21～q22。Decorin能與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ型膠原相互作用,但與Ⅰ型膠原關(guān)系最為密切[40]。Decorin能結(jié)合或修飾Ⅰ型膠原原纖維,調(diào)節(jié)膠原原纖維的重組和生長(zhǎng)。Decorin缺乏時(shí),Ⅰ型膠原纖維異常(韌性差、易脆),且生成減少。Decorin抑制病理性瘢痕的最主要機(jī)制之一是其抑制了TGF-β的作用,同時(shí)下調(diào)細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ前膠原的mRNA表達(dá),有效地抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖。目前多認(rèn)為,Decorin可通過(guò)旁分泌和自分泌的方式在 ECM 部位結(jié)合TGF-β1而起到中和 TGF-β1的作用,是自然條件下產(chǎn)生的TGF-β所致纖維化反應(yīng)的抑制劑。Decorin有兩個(gè)所有 TGF-β同工型的結(jié)合位點(diǎn),能與 TGF-β1、β2、β3結(jié)合,使其活性降低,它是 TGF-β 最重要的負(fù)調(diào)節(jié)劑,能抑制培養(yǎng)細(xì)胞TGF-β的生物活性。利用特殊抗體(6-B-6,LF-96)免疫標(biāo)記浸漬法,也發(fā)現(xiàn)Decorin的核心蛋白能夠抑制膠原纖維的生長(zhǎng),中和TGF-β,從而抑制纖維化[41]。

Decorin不僅在大鼠結(jié)締組織細(xì)胞而且在神經(jīng)系統(tǒng)中都有所表達(dá)。Decorin基因主要表達(dá)在施萬(wàn)細(xì)胞(SCs)和前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,周圍神經(jīng)系統(tǒng)中Decorin mRNA的表達(dá)與在CNS和其他非神經(jīng)組織中的表達(dá)相比,穩(wěn)定性和表達(dá)水平更高。神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的Decorin能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞外膠原基質(zhì),促進(jìn)軸突纖維結(jié)合蛋白黏附、SCs增殖和/或不同神經(jīng)細(xì)胞的存活[42]。實(shí)驗(yàn)表明,把人類重組核心蛋白多糖(human recombinant Decorin,hr-Decorin)快速注入被戳傷的大鼠脊髓背側(cè)柱傳導(dǎo)通路內(nèi),可以有效抑制炎癥反應(yīng)、AS纖維化增生、多種軸突生長(zhǎng)抑制因子(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG),從而可以促進(jìn)軸突生長(zhǎng)穿過(guò)損傷界面。Decorin可以高效(90%)抑制CSPG,說(shuō)明它不僅可以抑制CSPG的合成,還可以促進(jìn)CSPG的降解。因?yàn)榻z氨酸蛋白酶能夠降解CSPG及其酶原,所以在研究Decorin治療大鼠急性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Decorin能夠增加纖維蛋白溶酶原(plasminogen)/纖維蛋白溶酶(plasmin)的合成。在脊髓損傷后注射hr-Decorin第8天,可以分別使損傷界面內(nèi)纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的蛋白水平升高10和17倍;在體外,hr-Decorin可以使小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的纖維蛋白溶酶原mRNA升高3倍。纖維蛋白溶酶除了能夠降解膠質(zhì)瘢痕內(nèi)多種軸突生長(zhǎng)抑制的成分之外,還能夠激活神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和促進(jìn)CNS的重建[43]。

4.2 移植衍生型限制性AS前體細(xì)胞 衍生型限制性膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(GRP-derived astrocytes,GDAs)是限制性膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(glial-restricted precursor,GRP)通過(guò)MBP4產(chǎn)生的新型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞種類。GDAs移植治療脊髓損傷較GRP移植具有更理想的功能,不僅具有類似于AS促進(jìn)神經(jīng)軸突再生和保護(hù)神經(jīng)的生理功能,而且能夠有效誘導(dǎo)新生的AS成線性排列,為神經(jīng)軸突再生和生長(zhǎng)提供理想的通道,調(diào)控AS的過(guò)度增殖和膠質(zhì)瘢痕的形成。在利用GRP移植治療脊髓背側(cè)橫斷大鼠的實(shí)驗(yàn)中,移植GRP治療后確實(shí)改變了軸突生長(zhǎng)錐的形態(tài),而且在GRP細(xì)胞移植物中找到了再生軸突的神經(jīng)纖維,但是并沒(méi)有觀察到軸突長(zhǎng)距離再生,表明未分化的GRP細(xì)胞不能促進(jìn)脊髓背側(cè)軸突的再生[44]和行為能力[45]的恢復(fù)。分別利用GRP和GDAs移植治療脊髓背側(cè)橫斷大鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在損傷界面內(nèi)未能觀察到GRP細(xì)胞自身轉(zhuǎn)化為另一種能夠促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的細(xì)胞信號(hào),單獨(dú)移植GRP細(xì)胞不能抑制瘢痕形成和提供軸突再生橋梁;紅核脊髓束(RST)損傷模型中的GRP細(xì)胞移植不能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù);而移植GDAs可以促進(jìn)出現(xiàn)超過(guò)60%的上行脊髓背側(cè)柱軸突生長(zhǎng)進(jìn)入損傷中心,其中66%的軸突超過(guò)了兩端的損傷界面。GDAs可以填充損傷的界面、抑制膠質(zhì)瘢痕形成、重新排列受體組織和延遲軸突生長(zhǎng)抑制因子蛋白聚糖的表達(dá)。從而說(shuō)明GDAs能夠非常有效地改善軸突再生的微環(huán)境,促進(jìn)急性脊髓損傷后軸突的生長(zhǎng);還可以抑制軸突切斷后CNS神經(jīng)元的萎縮和促進(jìn)行為能力顯著地恢復(fù)[46]。以前的實(shí)驗(yàn)表明,核心蛋白多糖介導(dǎo)的核心蛋白和CSPGs葡萄糖胺聚糖支鏈的抑制水平為脊髓損傷后軸突的生長(zhǎng)提供更多的可能[47]。GDA移植后,受抑制的CSPGs延遲表達(dá)在促進(jìn)軸突的再生方面具有重要的作用;在培養(yǎng)新的AS過(guò)程中,神經(jīng)蛋白聚糖和2型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(NG2)免疫反應(yīng)的缺失表明GDAs移植可以抑制信號(hào)分子,減少神經(jīng)蛋白的表達(dá)。GDAs的特點(diǎn)和功能,使其成為一種有吸引力新的修復(fù)CNS損傷的細(xì)胞類型[46]。

4.3 體外基因干預(yù) GFAP是AS內(nèi)特異性蛋白,基因位于17q21,與一些腫瘤相關(guān)基因nm23、erbB-2相鄰,與 1型神經(jīng)纖維瘤蛋白(NF1)、整合蛋白(integrin)β4、p53、生長(zhǎng)激素-1 和金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)-2基因同在17號(hào)染色體上。GFAP基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為3.8 kb mRNA,蛋白產(chǎn)物為中間絲結(jié)構(gòu)蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量5×105)。GFAP型中間絲在細(xì)胞核和細(xì)胞膜之間形成連接,參與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附、維持腦內(nèi)髓鞘形成和神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)以及作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等[48]。GFAP基因最早由Lewis等在1984年克隆并測(cè)序。該序列包含8個(gè)內(nèi)含子,9個(gè)外顯子,由9971個(gè)堿基組成。GFAP基因與其他中間絲序列,尤其是結(jié)蛋白和波形蛋白的堿基序列具有較高的同源性,其中與結(jié)蛋白的同源性達(dá)65%,與波形蛋白的同源性達(dá)67%,它們?cè)谶M(jìn)化上都屬于保守性較高的序列。所不同的是,GFAP基因內(nèi)含子中含有大量與Alu序列密切相關(guān)的重復(fù)序列,該序列很可能是一個(gè)插入元件。另一個(gè)有意義的結(jié)合特征就是其羧基端的絲氨酸和蘇氨酸殘基的高度保守性。這些氨基酸可能是中間絲的磷酸化和翻譯后修飾的潛在部位,提示這些部位可能是GFAP的重要功能部位。

通過(guò)在體外針對(duì)GFAP的目的基因,采取基因封閉、基因敲除和體外修飾等技術(shù),調(diào)控GFAP的表達(dá),從而抑制或延緩膠質(zhì)瘢痕形成,為神經(jīng)再生和功能重建創(chuàng)造良好的微環(huán)境。實(shí)驗(yàn)顯示,利用基因封閉技術(shù),在體外培養(yǎng)的AS被反義GFAP逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后,AS的生長(zhǎng)延緩、胞體縮小、變圓,突起回縮,核漿比例增大[9]。利用基因敲除技術(shù)將小鼠AS中GFAP和中間絲彈性蛋白基因敲除掉,結(jié)果抑制了GFAP和中間絲彈性蛋白在小鼠脊髓損傷處表達(dá),膠質(zhì)瘢痕明顯減少[49]。通過(guò)體外修飾培養(yǎng)的成年大鼠皮質(zhì)AS的GFAP基因,再以HIV-Ⅰ衍生型病毒載體將其移植到大鼠脊髓的損傷處,成功地觀察到植入的AS存活并整合到宿主中,保持分泌GFAP的能力在6周以上[50]。

5 問(wèn)題與展望

目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)脊髓損傷治療的實(shí)驗(yàn)研究花費(fèi)不少心血,但是還未找到有效的、切實(shí)可行的治療方法。擺在我們面前有3個(gè)難點(diǎn):①盡管我們發(fā)現(xiàn)很多神經(jīng)生長(zhǎng)因子,但單獨(dú)使用一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子時(shí),起效時(shí)間都很慢;②神經(jīng)細(xì)胞的再生非常緩慢,而損傷遠(yuǎn)端等不到修復(fù)結(jié)束就已經(jīng)失去功能;③在神經(jīng)的修復(fù)過(guò)程中,有很多因素起阻礙作用,如瘢痕、各種因子,有些機(jī)制還不明確,需要研究。其中AS增殖和膠質(zhì)瘢痕形成是影響軸突再生的一個(gè)重要方面。

為了有效抑制AS增殖和膠質(zhì)瘢痕形成,我們以往的實(shí)驗(yàn)一般都是采用某一種方法,很難有效控制AS增殖。脊髓損傷后AS被激活,從靜止態(tài)向活化態(tài)轉(zhuǎn)化,直至增殖態(tài),而且AS的這3種狀態(tài)往往并存,形成原因復(fù)雜,我們單獨(dú)運(yùn)用一種方法難以達(dá)到預(yù)想的效果。所以我們?cè)谥委熂顾钃p傷時(shí),要整體考慮AS的這3種狀態(tài),在脊髓損傷的早期,采用聯(lián)合抑制的方法,有效控制AS從靜止態(tài)向活化態(tài)轉(zhuǎn)化,避免AS達(dá)到增殖態(tài)。聯(lián)合抑制可以整體考慮AS激活的刺激因素,重點(diǎn)干擾AS周期的G1/S和G2/M轉(zhuǎn)折點(diǎn),兼顧消除已形成膠質(zhì)瘢痕,采用兩種或以上的方法進(jìn)行治療。我們可以用藥物控制損傷局部的炎性反應(yīng),抑制或消除一些刺激AS活化的細(xì)胞因子;利用基因修飾技術(shù)控制GFAP基因的合成和復(fù)制;用可以降解膠質(zhì)瘢痕的藥物或其他方法清除已形成的膠質(zhì)瘢痕。其中,前兩者是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。我們可以采用的治療策略有:①采用Olomoucine和反義DNA基因封閉技術(shù),控制GFAP基因復(fù)制、改善損傷微環(huán)境和抑制AS活化,適用于脊髓損傷的早期;②利用Decorin和GDAs移植控制微環(huán)境,改善或清除已形成的膠質(zhì)瘢痕,使之形成線性結(jié)構(gòu),利于軸突生長(zhǎng),適用于脊髓損傷的中、后期;③利用多種方式,針對(duì)各個(gè)不同的AS狀態(tài),采取聯(lián)合的方法抑制AS的增殖,并降解已形成的膠質(zhì)瘢痕,適用于脊髓損傷的中期。此外,還可以運(yùn)用其他的組合方式,針對(duì)AS所表現(xiàn)的具體情況靈活選擇。

總之,我們?cè)卺槍?duì)脊髓損傷后AS的增殖和膠質(zhì)瘢痕形成的實(shí)驗(yàn)研究中,除了積極探索某一種有效的抑制手段之外,利用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法,采用聯(lián)合抑制的策略可能是我們今后研究的重點(diǎn)。

[1]樊沛,賀西京.嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷應(yīng)用進(jìn)展[J].美中國(guó)際創(chuàng)傷雜志,2007,6(2):54-57.

[2]李玉飛,彭毓斌,朱艷平,等.星型膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元調(diào)控的研究進(jìn)展[J].解剖學(xué)雜志,2006,29(2):228-230.

[3]M adden KS,Kim WT,Cornell-Bell A.G lutamate,arachidonic acid,and calcium regulation in cultured hippocampal astrocytes:involvement in ischemia?[J].Adv Neurol,1996,71:53-59.

[4]Brune T,Deitmer JW.Intracellular acidification and Ca2+transients in cultured rat cerebellar astrocy tes evoked by glutamate ag onists and noradrenaline[J].Glia,1995,14(2):153-161.

[5]Wu H,Friedman WJ,Dreyfus CF.Differential regulation of neurotrophin expression in basal forebrain astrocytes by neuronal signals[J].J Neurosci Res,2004,76(1):76-85.

[6]F rossard N,Naline E,Olgart H?glund C,et al.Nerve growth factor is released by IL-1 beta and induces hyperresponsiveness of the human isolated bronchus[J].Eur Respir J,2005,26(1):15-20.

[7]M asuda S,Chikuma M,Sasaki R.Insulin-like growth factors and insulin stimulate erythropoietin production in primary cultured astrocy tes[J].Brain Res,1997,746(1-2):63-70.

[8]Brown RC,Mark KS,Egleton RD,et al.Protection against hypoxia-induced increase in blood-brain barrier permeability:role of tight junction protein and NFκ B[J].J Cell Sci,2003,116(Pt 4):693-700.

[9]朱舟,王偉,謝敏杰,等.CDK抑制劑Olomoucine對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,34(2):159.

[10]Bernaudin M,Tang Y,Reilly M,et al.Brain genomic response following hypoxia and re-oxygenation in the neonatal rat identification of genes that might contribute to hypoxia-induced ischemic tolerance[J].J Biol Chem,2002,277(42):39728-39738.

[11]Morita M,Kozuka N,Itofusa R,et al.Autocrime activation of EGF receptor promotes osciuation of glutamate-induced calcium increase in astrocytes cultured in rat cerebral cortex[J].J Neurochem,2005,95(3):871-879.

[12]Albrecht PJ,Dahi JP,Stoltfus OK,et al.Ciliary neurophic factor activates spinal cord astrocy tes stimulating their production and release of fibroblast g rowth factor-2,to increase motor neutron survival[J].J Exp Neurol,2002,173(1):46-62.

[13]Struve J,Maher PC,Li YQ,et al.Disruption of the hyaluronanbased extracellular matrix in spinal cord promotes astrocy te proliferation[J].Glia,2005,52(1):16-24.

[14]Holley JE,Gveric D,Whatmore JL,et al.Tenascin C induces a quiescent phenotype in cultured adult human astrocytes[J].Glia,2005,52(1):58.

[15]Gimé nez Y,Ribotta M,Menet V,et al.The role of astrocytes in axonal regeneration in the mammalian CNS[J].Prog Brain Res,2001,132:587-610.

[16]李建明,初同偉.脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的病理變化及相關(guān)治療措施進(jìn)展[J].中國(guó)脊柱脊髓雜志,2007,17(8):632-634.

[17]Hobohm C,Günther A,Grosche J,et al.Decompsition and longlasting down regulation of ex tracellular matrix in perineuronal nets induced by focal cerebral ischemia in rats[J].J Neurosci Res,2005,80(4):539-548.

[18]Tang X,Davies JE,Davies SJ.Changes in distribution,cell associations,and protein expression levels of NG2,neurocan,phosphacan,brevican,versican V2,and tenascin-C during acute to chronic maturation of spinal cord scar tissue[J].J Neurosci Res,2003,71:427-444.

[19]M cKeon RJ,Schreiber RC,Rudge JS,et al.Reduction of neurite outgrowth in a model of glial scarring following CNS injury is correlated with the ex pression of inhibitory molecules on reactive astrocy tes[J].J Neurosci,1991,11:3398-3411.

[20]M cKeon RJ,Jurynec MJ,Buck CR.T he chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocy tes in the chronic CNS glial scar[J].J Neurosci,1999,19:10778-10788.

[21]Berry M,Max well WL,Logan A,et al.Deposition of scar tissue in the central nervous system[J].Acta Neurochir Suppl(Wien),1983,32:31-53.

[22]Alonso G.NG2 proteoglycan-expressing cells of the adult rat brain:possible involvement in the formation of glial scar astrocy tes following stab wound[J].Glia,2005,49(3):318-338.

[23]West H,Richardson WD,Fruttiger M.Stabilization of the retinal vascular network by reciprocal feedback between blood vessels and astrocytes[J].Development,2005,132(8):1855-1862.

[24]Davies SJ,Goucher DR,Doller C,et al.Robust regeneration of adult sensory ax ons in degenerating white matter of the adult rat spinal cord[J].J Neurosci,1999,19:5810-5822.

[25]Davies SJ,Fitch M T,Memberg SP,et al.Regeneration of adult axons in white matter tracts of the central nervous sy stem[J].Nature,1997,390:680-683.

[26]Davies SJ,Field PM,Raisman G.Long interfascicular axon growth from embry onic neurons transplanted into adult myelinated tracts[J].J Neurosci,1994,14:1596-1612.

[27]Pettigrew DB,Crutcher KA.White matter of the CNS supports or inhibits neurite outgrowth in vitro depending on geometry[J].J Neurosci,1999,19:8358-8366.

[28]Kozuka N,Itofusa R,Kudo Y,et al.Lipopoly saccharide and proinflammato ry cy tokines require different astrocytes states to induce nitric oxide production[J].J Neurosci Res,2005,82(5):717-728.

[29]Wingrave JM,Sribnick EA,Wilford GG,et al.Higher calpastatin levels correlate with resistance to Calpain-mediated proteoly sis and neuronal apoptosis in juvenile rats after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2004,21:1240-1254.

[30]Hung KS,Hwang SL,Liang CL,et al.Calpain inhibito r hibits p35-p25-Cdk5 activation dcreases tau hyperphosphorylation,and improves neurological function after spinal cord hemisection in rats[J].J Neuropathol Exp Neurol,2005,64(1):15-26.

[31]Ray SK,Matzelle DD,Wilford GG,et al.Inhibition of calpain-mediated apoptosis by E-64 d-reduced immediate early gene(IEG)expression and reactive astrogliosis in the lesion and penumbra following spinal cord injury in rats[J].Brain Res,2001,916(1-2):115-126.

[32]Krüger S,Müller H.Correlation of morphometry,nuclear organizer regions,proliferation cell nuclear antigen and Ki-67 antigen expression with grading and staging in urinary bladder carcinomas[J].Br J Urol,1995,75:480.

[33]田代實(shí),王偉,徐運(yùn)蘭,等.細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑Olomoucine對(duì)大鼠脊髓損傷后軸突再生微環(huán)境的影響及其意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,86(13):901-905.

[34]King KL,Cidlowski JA.Cell cycle regulation and apoptosis[J].Annu Rev Phy siol,1998,60:60.

[35]Abraham RT,Acquarone M,Andersen A,et al.Cellular effects of Olomoucine,an inhibitor of cyclin-dependent kinases[J].Biol Cell,1995,83:105.

[36]Krystof V,McNae IW,Walkinshaw M D,et al.Antiproliferactivity of OlomoucineⅡ,a noval 2,6,9-trisubstituted purine cyclin-dependent kinase inhibitor[J].Cell M ol Life Sci,2005,62(15):1763-1771.

[37]Cernak I,Stoica B,By rnes KR,et al.Role of the cellcycle in the pathobiology of central nervous sy stem trauma[J].Cell Cycle,2005,4(9):1286-1293.

[38]Cafferty WB,Gardiner NJ,Das P,et al.Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice[J].J Neurosci,2004,24:4432-4443.

[39]Scott PG,McEwan PA,Dodd CM,et al.Crystal structure of the dimeric protein core of Decorin,thearchety palsmall leucine-rich repeat proteog lycan[J].Proc Natl Acad Sci,2004,101(44):15633-15638.

[40]Batbayar T,Nomura Y,Ishii Y,et al.Affinity of placental Deco rin for collagen[J].Biosci Biotechnol Biochem,2000,64(11):2478-2481.

[41]Fukui N,Fukuda A,Kojima K,et al.Suppression of fibrous adhesion by proteoglycan Decorin[J].J Orthop Res,2001,19(3):456-462.

[42]Hanemann CO,Kuhn G,Lie A,et al.Expression of Decorin mRNA in the nervous system of rat[J].J Histochem Cy tochem,1993,41(9):1383-1391.

[43]Davies JE,Tang XF,Bournat JC,et al.Decorin promotes plasminogen/plasmin expression within acute spinal cord injuries and by adult microglia in vitro[J].J Neurotrauma,2006,23(3-4):397-408.

[44]Hill CE,Proschel C,Noble M,et al.Acute transplantation of glial-restricted precursor cells into spinal cord contusion injuries:survival,defferentiation,and effects on lesion environment and axonal regeneration[J].Exp Neural,2004,190(2):289-310.

[45]Cao Q,Xu XM,Devries WH,et al.Functional recovery in traumatic spinal cord injury after transplantation of multineurotrophin-expressing g lial-restricted precurso r cells[J].J Neurosci,2005,25:6947-6957.

[46]Davies JE,Huang C,Proschel C,et al.A strocytes derived from glial-restricted precursors promote spinal co rd repair[J].J Biol,2006,5(3):7.

[47]Davies JE,Tang X,Denning JW,et al.Decorin suppresses neurocan,brevican,phosphacan and NG2 expression and promotes ax on growth across adult rat spinal cord injuries[J].Eur J Neurosci,2004,19:1226-1242.

[48]卞修武.膠質(zhì)纖維酸性蛋白基因調(diào)控及其在膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)分化中的作用[J].中華病理學(xué)雜志,1999,28(3):222-223.

[49]Menet V,Prieto M,Privat A,et al.Axonal plasticity and functional recovery after spinal cord injury in mice deficient in both glial fibrillary acidic protein and vimentin genes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(15):8999-9004.

[50]Pencalet P,Serguera C,Corti O,et al.Integration of genetically modified adult astrocytes into the lesioned rat spinal cord[J].J Neurosci Res,2006,83(1):61-67.