劉寶生 尚雅靜 張日俊

隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，抗生素的超量使用給畜牧業(yè)帶來的種種弊端日漸成為普通百姓關(guān)注的活題。致病菌中能耐受幾乎所有抗生素的“超級細菌”的出現(xiàn)更成為桎梏畜牧業(yè)進一步發(fā)展的關(guān)鍵。全面停止抗生索在動物飼料中的添加，嚴格區(qū)分人、畜抗生素在疾病防治中的應(yīng)用便成了全球人們的共同呼聲。因而盡快尋找一種(類)能完全取代抗生素在畜牧業(yè)中作用的產(chǎn)品便成為廣大科學(xué)工作者不斷努力的方向。細菌素是一類由細菌分泌的通過在其他細菌的細胞膜上形成孔隙或影響細菌細胞內(nèi)某些代謝過程的高效抗菌蛋白類物質(zhì)，其作為一種長期存在于自然環(huán)境中的，具有天然抑(殺)菌能力的小分子蛋白類物質(zhì)，目前已成為廣大科學(xué)工作者研究和開發(fā)的焦點。在國外，這方面的研究自20世紀(jì)七八十年代就已開始，而國內(nèi)有關(guān)細菌素用于動物疾病防治的研究報道尚未見公開發(fā)表。筆者僅就細菌素在動物疾病防治中的應(yīng)用研究作一綜述，為進一步加速我國對細菌素在動物疾病防治中的應(yīng)用和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1.細菌素的性質(zhì)

細菌索是廣泛存在于生活細菌周圍的一類由核糖體合成的蛋白或多肽類物質(zhì)，是細菌在生活中為了爭奪營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間而分泌到周圍環(huán)境中的、對其他細菌(尤其是具有近緣關(guān)系的細菌或菌株)具有抑制或殺滅作用的蛋白類物質(zhì)，分泌菌自身對其具有免疫能力。細菌素與肽類抗生素的區(qū)別是前者是由基因編碼、核糖體合成的一類胞外分泌蛋白，而后者則是細菌在生活過程中由多種酶類共同參與合成的蛋白類次級代謝產(chǎn)物(它沒有自己的編碼基因，也不是在核糖體內(nèi)合成的)。細菌素與肽類抗生素的共同之處是兩者都是蛋白類抗菌活性物質(zhì)，都對各自的敏感菌具有強烈的抑制或殺滅作用。細菌素是細菌在生存競爭中的一種重要武器，自然界中99%的細菌都具有分泌一種或多種細菌素的能力。細菌素如此大規(guī)模的天然儲備是細菌素全面取代抗生素的一個得天獨厚的有利條件。

2.細菌素的生產(chǎn)與制備

細菌素的生產(chǎn)通常有2種方式：利用高產(chǎn)細菌素的天然菌株進行生產(chǎn)；利用工程菌株對細菌素的目的基因進行高效表達。前者產(chǎn)量通常較低，但所得細菌素的抗菌活性卻非常穩(wěn)定可靠，常用于實驗室階段的研究；后者利用成熟的基因工程表達系統(tǒng)將編碼細菌素的目的基因進行高效表達，從而達到大規(guī)模生產(chǎn)細菌素的目的，是細菌素商品化的首選生產(chǎn)方式。但不管是天然菌還是工程菌發(fā)酵所生產(chǎn)的細菌素通常都是溶解在培養(yǎng)基中的混合物，還要經(jīng)過鹽析、超濾、層析等一系列的分離純化才能獲得相應(yīng)的純品或半純品，有的還要進行干燥、包被或膠囊化后才能用于各種試驗和生產(chǎn)實踐中。

3.細菌素在動物疾病防治中的作用

3.1 細菌素抗動物致病菌的體外試驗效果

大量的體外試驗表明，細菌素對動物體內(nèi)的各種致病菌都具有強烈的抑殺作用。細菌素的特征之一就是大多只對與分泌菌有近緣關(guān)系的菌株具有抑殺作用，利用這一特點，Etcheverria等在牛的結(jié)腸中分離到了能通過分泌細菌素來抑制大腸桿菌O157：H7的非致病性大腸桿菌，這對畜牧業(yè)中有效控制致病性大腸桿菌0157：H7的感染具有重要意義，同時也為控制動物的其他腸道致病菌提供了一個很好的思路。但最近越來越多的研究結(jié)果表明細菌素也具有廣譜抑(殺)菌的能力，而且在抑殺致病菌方面與相應(yīng)的抗生索具有同等效力。Xie等在長期的細菌素研究中分離到多株具有高產(chǎn)、廣譜、高效抑(殺)菌能力的細菌素生產(chǎn)菌株。國外的研究也表明細菌素不僅對G+菌具有抑制作用，而且對G-菌也具有良好的抑制效果，在這些被抑殺的致病菌中既有好氧菌，也有厭氧菌。

體外試驗結(jié)果還表明，細菌素不僅對普通的致病菌具有抑殺作用，更重要的是細菌素對那些已經(jīng)對抗生素產(chǎn)生耐藥性的致病菌依然表現(xiàn)出強烈的抑殺作用。Galvin等報道，廣譜抗菌的細菌素Lacticin 3147對抗二甲氧基芐青霉素的金黃色葡萄球菌、抗萬古霉索的糞腸球菌、抗青霉素的肺炎球菌都具有抑殺作用。細菌素對抗生素耐藥性菌株的抑殺作用是基于其與抗生素完全不同的殺菌機理。事實上，細菌素最初之所以能被廣大科技工作者重視的一個主要原因就是Nisin能有效抑制在低溫環(huán)境下仍具有頑強生命力的致病性單胞李斯特氏菌。因此，細菌素對致病菌的抑殺作用一直以來都是對細菌素研究的一個核心。

3.2 細菌素在動物疾病防治中體表給藥的試驗效果

體外試驗的絕佳效果推動了細菌素作為一種新型獸藥用于動物疾病防治的嘗試。對細菌素來說，在動物疾病防治中址直接的應(yīng)用方式就是在動物的體表用藥，其中研究最多的是細菌素在乳牛乳腺炎防治中的應(yīng)用。Oliveira等的研究發(fā)現(xiàn)，分離自乳牛乳腺炎的65株致病菌全部都對由金黃色葡萄球菌質(zhì)粒pRJ9產(chǎn)生的細菌素敏感。細菌素Lacticin 3147和Nisin的在體試驗均表明細菌素可有效預(yù)防乳牛乳腺炎的發(fā)生而不會產(chǎn)生任何副作用。在人醫(yī)上，利用細菌素來防治粉刺也取得了良好的試驗效果。

3.3 口服細菌素對動物疾病防治的試驗效果

口服給藥是動物疾病防治中最常用的一種給藥方式。但因為細菌素自身的蛋白質(zhì)特性，細菌素的作用活性易受周圍環(huán)境因素的影響，而且易被動物體內(nèi)的某些酶部分降解。消化道中的內(nèi)容物成分復(fù)雜，而且還含有大量能分解蛋白質(zhì)的蛋白酶類，這使細菌素的消化道給藥一直以來成為細菌素作為藥用的一個難點。Gardiner等給斷奶后5周的生長豬空腹飼喂200 ml。含Lacticin 3147為5000AU／mL的復(fù)活液和200g的開食料，飼喂后2h采集胃、空腸和回腸內(nèi)容物檢測Lacticin 3147的含量，結(jié)果表明，細菌素Lacticin 3147在動物采食后第2h在消化道各段內(nèi)均無法檢測到其活性的存在，質(zhì)譜檢測結(jié)果進一步表明胃腸道中并沒有細菌

素Lacticin 3147的殘存。同樣的結(jié)果來自Bernbom等的研究，飼喂Nisin的小鼠經(jīng)ELISA檢測，其小腸食糜和糞便中 Nisin含量分別是其生物活性的10倍和200倍，這說明進入小鼠腸道內(nèi)的Nisin很快就會在消化道內(nèi)分解成碎片。由此看來，細菌素在進入動物的消化道后確實會被消化道內(nèi)的消化酶部分或全部降解。此外，Gardiner等將Lacticin 3147與豬的糞便混合，發(fā)現(xiàn)細菌素的活力在0.5h內(nèi)就下降了70%，到1h時只剩1.5%，這也說明腸道內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境(內(nèi)容物的吸附作用、酶、微生物、pH等的影響)對細菌素的活性的確有很大的影響。

盡管細菌素在動物消化道內(nèi)的作用會受到大量不利因素的影響，但仍有不少細菌素通過口服給藥獲得了良好效果的試驗報道。Stern等通過人工感染的方法，使剛孵出的小雞感染空腸彎曲菌，從第7d起，連續(xù)3d用經(jīng)PVP包被的細菌素OR-7進行治療，結(jié)果表明口服經(jīng)微膠囊包被的細菌素可以極顯著地降低家禽腸道內(nèi)空腸彎曲菌的數(shù)量。Rea等通過模擬腸道環(huán)境，證明細菌素Lacticin 3147即使在18μg／ml。的低濃度下，仍然可以將動物腸道內(nèi)高達1X106CFU／mL的頑固性痢疾梭菌完全清除。Corr等還通過試驗證明了產(chǎn)細菌素的唾液乳桿菌進入小鼠胃腸道后，能有效防止單胞李斯特氏菌感染的是它分泌的細菌素Abpll8而不是乳桿菌本身，這也從另一個側(cè)面證實了細菌素在動物腸道內(nèi)仍可有效發(fā)揮其抗菌作用的功能。事實上細菌素對細菌的抑殺作用是非常迅速的，在一定條件下(如進行物理包被、化學(xué)修飾等)，細菌素完全可以在它被消化道內(nèi)的酶降解之前完成其殺菌的作用。此外，最新的研究結(jié)果表明，細菌素還可以通過形成環(huán)狀或某些特殊的氨基酸來增強抗動物胃腸道消化酶降解的能力。但細菌素作為一類分子質(zhì)量較小的活性肽是否能夠有效通過動物胃腸道粘膜上皮細胞而進入血液對動物體的系統(tǒng)感染起到預(yù)防和治療作用至今尚未見報道。

3.4 高純度細菌素腹腔和靜脈注射的試驗效果

Mota-Meira等的研究結(jié)果表明，腹腔注射的細菌素mutacin B-Ny266和萬古霉素一樣可以有效地治療由金黃色葡萄球菌引起的小鼠腹腔感染，當(dāng)對照組的死亡率高達70%～100%時，試驗組無1例出現(xiàn)死亡。Ingham等通過靜脈注射純化的細菌素Piscicolin 126(P126)來治療由靜脈注射單胞李斯特氏菌引發(fā)的小鼠全身性感染，結(jié)果表明：細菌素P126在注射到小鼠體內(nèi)后仍然保持抗單胞李斯特氏菌的活性，在李斯特氏菌感染的早期，靜脈注射細菌素P126能明顯減少李斯特氏菌在肝、脾的附著，減輕李斯特氏菌感染的臨床癥狀。這些結(jié)果表明，高純度的細菌素可以通過腹腔或靜脈注射的方式用來控制和治療動物體全身性細菌感染性疾病。大多情況下，細菌素注射后引起的副作用或溶血性反應(yīng)主要是因為其中含有較多雜質(zhì)的原因。研究表明，與真核抗菌肽magainin不同，高純度的細菌素Nisin并不會引起人的紅細胞產(chǎn)生溶血。此外，Reddy等的研究也表明，陰道內(nèi)使用Nisin后，Nisin可以迅速透過陰道的粘膜上皮而進入血液中，進入血液中的Nisin可以在血液循環(huán)中被迅速清除，對動物自身的生長和生殖不會產(chǎn)生任何明顯的影響。

3.5 細菌素的體外抗癌作用

體外試驗表明，細菌素還具有抗癌的功效。在20世紀(jì)80年代，由于試驗中所用的細菌素大多為粗提物，所以很少有關(guān)于細菌素具有抗癌性能的相關(guān)報道。隨著高度純化的細菌素的出現(xiàn)，越來越多的試驗結(jié)果表明細菌素對多種癌細胞系具有拮抗作用?，F(xiàn)已證明具有抗癌作用的細菌素有Vibriocin、Pyocin、Colicin、Pediocin和Microcin等。早在1976年Farkas-Himsley和Cheung就對包括Colicin在內(nèi)的多種細菌素進行了試驗，他們發(fā)現(xiàn)癌細胞對細菌素的敏感性要比普通細胞強，而且還發(fā)現(xiàn)動物的癌細胞要比人的癌細胞對細菌素更敏感。Abdi-Ali等的研究也表明細菌素PyocinS2只對癌細胞有抑制作用，而對正常的細胞不會產(chǎn)生抑制作用。雖然試驗的結(jié)果顯示細菌素對動物的癌細胞具有抑殺作用，但其作用的機理是否與抑殺細菌的作用機理一樣，目前還不得而知。但有報道稱Colicins E3和E5對癌細胞的抑制作用是引起癌細胞的壞死而不是引發(fā)細胞的凋亡，而對Microcin E492的研究表明，低濃度的Microcin E492即可引發(fā)Hela細胞的凋亡，而在高濃度時則可直接導(dǎo)致Hela細胞的壞死。

4.細菌素的抑(殺)菌機理

自從1925年比利時學(xué)者Gratia發(fā)現(xiàn)第一種細菌素——Colicin以來，據(jù)不完全統(tǒng)計，截至2007年6月已有近300種細菌素被分離純化出來。這些細菌素中絕大部分都攜帶有一定量的凈正電荷，且多肽鏈中75%以上都含有5～20個不等的疏水性氨基酸。這些凈正電荷和由疏水性氨基酸構(gòu)成的雙親特性正是大多數(shù)細菌素對細菌具有抑殺作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

大量的研究表明，細菌素對細菌的拮抗作用不 僅僅是抑制細菌的生長，同時也對細菌具有強烈的殺滅作用。當(dāng)細菌素作用于目標(biāo)菌株時，它可以由自身所帶的正電荷與細菌細胞膜上所帶的負電荷之間產(chǎn)生的靜電吸附或細菌素與細菌細胞膜之間產(chǎn)生的疏水相互作用而向細菌靠近，并最終吸附在細菌的細胞膜上。在低劑量時，細菌素可以利用自身的雙親特性在細菌的細胞膜上形成跨膜的微小孔道。這些微孔足以讓細菌細胞質(zhì)內(nèi)的各種小分子物質(zhì)(如H+、K+及各種有機小分子)滲漏到細胞膜外，從而使細菌細胞內(nèi)外的質(zhì)子動力勢(PMF)和電勢差消失。細菌為了恢復(fù)原有的細胞內(nèi)外的離子和電勢的平衡，就會不斷通過水解ATP的方式將泄漏到細胞外的離子和小分子物質(zhì)重新運回細胞內(nèi)，這樣一來，細菌最終會因為ATP的耗盡而又無法恢復(fù)細胞內(nèi)外的離子和電勢的平衡而枯竭至死。當(dāng)細菌素的濃度較大時，大量吸附在菌體細胞膜上的細菌素可以影響菌體細胞膜的性狀，使細胞膜出現(xiàn)瞬時的缺口,吸附在菌體細胞膜上的細菌素即可通過這種瞬時的缺口進入細菌的細胞質(zhì)內(nèi)。這些進入細胞質(zhì)內(nèi)的細菌素即可影響細菌細胞內(nèi)的多種代謝過程，如DNA的合成、RNA的轉(zhuǎn)錄、細胞壁的合成等等，從而發(fā)揮抑(殺)菌作用。同時，進入細胞質(zhì)內(nèi)的細菌素還可以進一步吸附在細菌細胞膜的內(nèi)側(cè)。細菌在細胞膜內(nèi)外的細菌素的共同影響下，細胞膜出現(xiàn)較大的裂口，細胞內(nèi)的物質(zhì)(包括大分子有機物如ATP、核酸、蛋白質(zhì)等)大量擴散到細胞外，從而導(dǎo)致細菌死亡，有的甚至可以導(dǎo)致整個細菌細胞裂解，細胞不復(fù)存在。

5.細菌素在動物疾病防治中的安全性評價

耐藥性是所有抗菌性藥物必然會遇到的一個問題，細菌素與抗生素一樣也會有耐藥性菌株的出現(xiàn)。但其出現(xiàn)的概率在1×10-9～1×10-8之間，比抗生素的概率要低得多。其原因是細菌素的作用機理與大多抗生素不同，細菌素對致病菌的殺滅作用是基于細菌素和致病菌自身的一些物理特性完成的，因此發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥性的概率就變得非常低。但仍有不少研究結(jié)果表明，致病菌可以通過改變細胞膜的不飽和脂肪酸和(或)帶正電荷氨基酸殘基的含量及改變細胞膜磷脂的組成來改變細胞膜的結(jié)構(gòu)，降低細胞表面負電荷的含量，對細菌素產(chǎn)生抗性。

藥理、毒理的研究是細菌素用于動物疾病防治的必備資料，也是現(xiàn)今開發(fā)各種細菌索在動物疾病防治中的應(yīng)用的一個關(guān)鍵性任務(wù)，但直到目前，有關(guān)這方面的報道非常少。Drewa等通過在培養(yǎng)基中加入細菌索Staphylococcin T的方法研究了細菌素對哺乳動物成纖維細胞的影響，結(jié)果表明，使用細菌索后成纖維細胞的形態(tài)沒有產(chǎn)生明顯的變化。為了進一步開發(fā)Nisi在婦女生殖健康及避孕上的應(yīng)用，Reddy等在家兔和小鼠上進行了一系列急性毒性和慢性毒性試驗，所有的結(jié)果都一致表明Nisin的使用不會對動物本身及其后代產(chǎn)生任何不良影響。

總之，細菌素是細菌自身產(chǎn)生的對其他細菌或菌株具有抑殺作用的一類蛋白類物質(zhì)，它對對各種致病菌都具有很強的抑殺活性，在動物體內(nèi)使用后通常很難產(chǎn)生耐藥性，也不會有任何的殘留，是目前各類抗菌物質(zhì)中有望完全取代抗生索并在畜牧業(yè)中應(yīng)用的一類理想替代品。隨著對細菌素在動物疾病防治中應(yīng)用研究的不斷深入，有理由相信細菌素必將為今后畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮巨大的作用。