高劍鋒 劉春山
五味子(Conman Magnolcavine fruit)為木蘭科五味子屬(Schisabdrachinensis(Turcz)baill.)和南五味子屬(S.sphenanthera Rend.et Wils)植物的泛稱。全世界約有50種,主要分布在中國、韓國、日本及俄羅斯遠東地區(qū)等。五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,并列為上品,已有2000年的藥用歷史。李時珍在《本草綱目》中記載,“五味子今有南北之分,南產(chǎn)者紅,北產(chǎn)者色黑,入滋補藥,必用北產(chǎn)者乃良[1]?!蔽逦蹲游端帷⒏?,性溫。有收斂固澀、補腎寧心、益氣生津、止瀉的功能。用于肺虛咳嗽、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、慢性腹瀉、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥[2]。本文將對現(xiàn)有資料的進行整理,對五味子植物的種屬與分布、生物學(xué)特性、遺傳參數(shù)的相關(guān)性、鑒別方法等進行綜述。
對于五子味的科屬問題一直有爭議,傳統(tǒng)認為五味子歸屬于木蘭科。而劉玉壺[3]將五味子科提升為五味子目;五味子科下設(shè)南五味子屬和五味子屬。五味子屬下隸多蕊五味子亞屬、中華五味子亞屬、團蕊五味子亞屬、重瓣五味子亞屬、五味子亞屬和少蕊五味子亞屬(共6亞屬)[4,5],因此五味子屬于五味子科五味子屬。
1.1 木蘭科五味子屬植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實,習(xí)稱“北五味子”,分布于東北、華北地區(qū),性溫,味酸,甘。
1.2 同屬植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehdetwils的果實。俗稱“南五味子”,分布于華中、西南及山西、陜西、甘肅等地,含去氧五味子素約1.76%,五味子酯甲、乙、丙、丁、戊等成分。
1.3 同屬植物翼梗五味子Schisandrahenryiclarke的果實。主產(chǎn)于四川各地。
1.4 同屬植物紅花五味子SchisandrarubrifloraRehd.etwils的果實。分布于四川、云南等地。
1.5 同屬植物球蕊五味子chisandrasphaerandraStapf的果實。
1.6 大花五味子S.grandiflora(Wall.)Hook.f.&Thoms的果實。主產(chǎn)于西藏、云南等地。
1.7 同屬植物興山五味子Schisandraincarnata的果實,分布于湖北西部。在當(dāng)?shù)厮追Q“北五味子”,但與《中國藥典》收載的“北五味子”不同,它的植物形態(tài)、性狀和化學(xué)成分也與“北五味子”稍有不同。本品在甘肅南部也有新的發(fā)現(xiàn)。
1.8 滇藏五味子S.neglecta A.C.Smith的果實。主產(chǎn)于四川、云南、西藏等地。
1.9 木蘭科南五味子屬(Kadsura)植物如南五味子K.japenciaDunal、長梗五味子K.longipeduncalataFinetetGagnap等的果實,亦具有藥用價值。此外,還有五味子屬Shisandra植物中華五味子S.propingua(Wall)Bail.Var.Sinensisaliv.披針葉五味子S.LancifoliaA.C.Smith、小花五味子S.micrantha.A.C.Smith、娥眉五味子S.henryi.C.B.clark、白五味子S.henryi.C.B.Clarke Var Yunnanensis A.C.Smith、 毛葉五味子S.pubescensHemsl.etwils、綠五味子S.riridisA.C.Smith等的果實。
1.10 生長環(huán)境以海拔700m左右的樣地調(diào)查數(shù)據(jù)為例,分析野生五味子資源的生長情況。從海拔700m左右五味子的生長狀況來看,淺山區(qū)的野生五味子分布稀疏,且幼嫩小苗占了50%以上,并且伴有輕微的病蟲害,植被破壞比較嚴(yán)重。相比而言,深山區(qū)的野生資源破壞較少,生長狀況和蘊藏量與往年差別不大,長勢良好。這與深山林區(qū)的管理和保護有著直接的關(guān)系,人為因素影響較少,野生資源狀況良好。在實地調(diào)查中發(fā)現(xiàn),五味子在植株形態(tài)上存在一定的變異,如在湯原見到的五味子同一分布區(qū)存在莖紅色和綠色兩種變異類型。葉子的變異最為明顯,主要表現(xiàn)在形狀和顏色兩個方面。調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)有的葉子細長而尖,而有的寬而圓鈍,在顏色上也有深淺的差異。不同五味子變異類型對五味子有效成分的影響同樣有待進一步的研究。
周德本等[6]采用全面條調(diào)查和定株觀察相結(jié)合的方法,對野生北五味子的生物學(xué)特性作過比較詳細的研究,并對野生北五味子的芽、花的生物學(xué)特性、結(jié)果的規(guī)律特性、生長的節(jié)律特性等都作了比較詳細的論述。
芽為混合芽,長5mm,被有數(shù)枚暗褐色鱗片,每個花芽內(nèi)多著生2~4花蕾(偶見5~7);花蕾綠色,圓球形,雌雄花蕾外觀上區(qū)別甚小,解剖后,解剖鏡下可見不成形的淺綠色物,為雌花蕾;而能較清晰地觀察到近乎白色花藥雛形者為雄花蕾;花單性?;ü诙嗳榘咨家姺奂t色,且其花冠大于白色花冠,花聚生于葉腋,幼枝上葉互生,老莖(枝)上葉簇生?;o蜜腺,風(fēng)媒花,雄花開后3~5d進入花粉期。雌雄花除上述區(qū)別外,經(jīng)調(diào)查新發(fā)現(xiàn)雌花花柄明顯長于雄花花柄?;ㄆ?0d左右,單朵雌雄花始至末期4~6d。單株花果0~600朵之間,一般3~4年,0~200朵,5~6年生20~300朵,7年生以上100~600朵。通過多年性別的調(diào)查確認北五味子屬雌雄同株植物,偶爾有異株現(xiàn)象,除同株外只見雄株,末見雌株,這與原來“雌雄異株”的記載有所不同,而這種所謂的雄株是由于環(huán)境因子不同而產(chǎn)生的。尤為明顯和重要的是光因子。
北五味子3~4年開始結(jié)實,6~10年為結(jié)實盛期。研究發(fā)現(xiàn),同齡北五味子攀援2m高以內(nèi)樹木上的較攀援在5m左右樹木上的結(jié)實要好要多。纏繞在山里紅、毛榛子植株上的生長、結(jié)實均較好。這與受光面積大,受光量多有關(guān)。
野生北五味子4月中下旬開始萌動,枝條由上至下變綠變?nèi)彳?,芽苞變綠,膨大,此時剝開已見花蕾;在5月中旬放葉盛期,花蕾已長出1~2.5cm花柄,葉芽長2~5cm,新枝伸長10~12cm,主蔓當(dāng)年可長高0.5~1.5m,基生枝為植株基部芽扎土串根所形成。根據(jù)立地條件的優(yōu)劣及受光程度,每個枝條上的芽成枝率在15%~100%,長短亦不等,一般向陽處芽發(fā)育成枝的較多,背陰處少。隨著枝條逐年增加,開花結(jié)實量也隨之大幅度增加,使枝條愈來愈密集。幾年后,植株下部的枝條常常枯死,結(jié)果部位外移。野生植株10年生以上者大多自然枯死,代之以串根所生成的其它植株仍在正常生長。果期花托伸長成穗狀聚合果(似果序),每串5~32粒,有0.7~4.9cm細長花柄。果序增長旺盛期始于6月上旬至7月中下旬,此后趨于平緩或停止。一般最大果序長10cm左右,寬2.3cm左右。
劉清瑋等[7]對遼寧省本溪縣北五味子示范園內(nèi)3年生成熟期北五味子主要性狀的遺傳參數(shù)及性狀間遺傳相關(guān)性分析,并在遺傳相關(guān)的基礎(chǔ)上對產(chǎn)量性狀進行逐步回歸和通徑分析。遺傳參數(shù)分析結(jié)果表明,果穗數(shù)、平均穗重、產(chǎn)量、地莖、穗粒數(shù)的變異系數(shù)較大,育種選擇潛力大。遺傳相關(guān)分析結(jié)果表明,產(chǎn)量及果穗數(shù)分別與地莖呈極顯著、顯著正相關(guān),與比葉重間呈極顯著負相關(guān)。逐步回歸分析表明:對產(chǎn)量貢獻較大的性狀主要有果穗數(shù)、平均穗重、果穗長和比葉重,其中比葉重對產(chǎn)量為負向效應(yīng)。通徑分析結(jié)果表明,與產(chǎn)量主要相關(guān)的5個性狀中,果穗數(shù)對產(chǎn)量的直接正向應(yīng)最大,總間接正向效應(yīng)值最小,果穗數(shù)對產(chǎn)量的直接效應(yīng)為正,總間接效應(yīng)為負,且直接效應(yīng)絕對值大于總間接效應(yīng),果穗長與地莖對產(chǎn)量的直接與間接效應(yīng)均為正向,且總間接效應(yīng)大于直接效應(yīng),比葉重對產(chǎn)量的直接效應(yīng)與間接效應(yīng)值均為負,直接效應(yīng)與間接效應(yīng)數(shù)值相差不明顯。
五味子果實呈不規(guī)則的球形或扁球形,直徑5~8mm,表面鮮紅色、紫紅色或暗紅色,有不整齊的皺縮,顯油潤,有時數(shù)個黏連在一起,有的表面呈黑紅色或出現(xiàn)“白霜”。果皮肉質(zhì)柔軟,內(nèi)含種子1~2粒,腎形,長4~5mm,表面棕黃色,有光澤,種皮薄,堅硬而脆,剝?nèi)ズ罂梢姷厣N仁,種臍在一側(cè),顯著凹入,顏色較深,胚乳淡黃色,油質(zhì),胚小,不易見。果皮氣微,味酸,種子破碎后,有香氣,味辛而微苦。南五味子果實呈不規(guī)則球形,較小,直徑2~5mm,表面暗紅色或棕褐色,干癟,皺縮。果皮肉質(zhì)較薄,常緊貼在種子上,無光澤,有時微有白色粉霜。內(nèi)含種子1~2粒,種子腎形,較北五味子種子略小,表面黃棕色,略呈顆粒狀,有光澤,種皮薄而脆,種臍在一側(cè),稍凹入,脊部粗糙,具有疣狀突起,胚乳富含油性。果肉氣微,味微酸。高建平等[8]用掃描電鏡方法對不同產(chǎn)地華中五味子及其近緣種綠葉五味子、翼梗五味子和紅花五味子果實進行生藥性狀、種子表面微形態(tài)鑒別。結(jié)果表明,依據(jù)種皮表面的微形態(tài)特征可以將華中五味子、紅花五味子、綠葉五味子及翼梗五味子分為3個類型。綠葉五味子和翼梗五味子種皮表面具瘤狀凸起屬Ⅲ 型;產(chǎn)于湖南衡山、甘肅小隴山和山西陽城的華中五味子種皮表面有微凸和細皺紋,在種子側(cè)面、腹面和背面的外側(cè)常有乳頭狀凸起,放大倍數(shù)為×200和×500時,細胞壁外凸呈疣狀,無次級紋飾,這類種子屬Ⅱ型;產(chǎn)于陜西留壩、平利和河南欒川的華中五味子及紅花五味子種皮表面較平滑,有細皺或微有凸起。放大倍數(shù)為×200和×500時,細胞壁突起呈疣狀而且在種皮表面的一些區(qū)域有次級紋飾,屬于Ⅰ型。種子表面是否有瘤狀凸起、是否有次級文飾是重要的鑒別點,據(jù)此將綠葉五味子和翼梗五味子與華中五味子和紅花五味子相區(qū)別,但是不能很好地區(qū)分華中五味子和紅花五味子。
五味子的外果皮為1列類方形細胞,每隔3~4個細胞即有1個油細胞。長方形,壁稍厚,內(nèi)含淡黃色油滴。中果皮細胞10余層,壁薄,含淀粉粒,內(nèi)側(cè)的細胞較外側(cè)者形大,薄壁組織中散有小型外韌型維管束;內(nèi)果皮為1列小方形薄壁細胞,排列整齊。種皮表皮細胞為1列長方形、徑向延長的石細胞,長約70μm,直徑為25~35μm,胞腔內(nèi)含棕色物質(zhì),壁厚,孔溝細密。其下為數(shù)列排列較疏松的石細胞,類圓形、三角形或多角形,長徑為70~130μm,短徑為30~80μm,壁較厚,紋孔較大,石細胞層下為數(shù)列薄壁細胞,種脊部位有維管束;其內(nèi)側(cè)為1列薄壁細胞,方形或類方形,排列整齊,內(nèi)含油滴;再下為3~5列小形細胞,種皮內(nèi)表皮為1列扁而較皺縮的小型薄壁細胞,壁稍厚;胚乳薄壁組織內(nèi)含脂肪油及淀粉粒。五味子粉末呈暗紫色,種皮表皮石細胞表面觀呈多角形或長多角形,直徑18~50μm,壁厚,孔溝極細密,胞腔內(nèi)含深棕色物,種皮內(nèi)層石細胞呈多角形,類圓形或不規(guī)則,直徑約為83μm,壁稍厚,紋孔較大。果皮表皮細胞表面觀類多角形,垂周壁呈連珠狀增厚,表面有角質(zhì)線紋,表皮中散有油細胞,直徑約為50μm。中果皮細胞皺縮,內(nèi)含深棕色物及淀粉粒。南五味子粉末呈暗棕色。種皮表皮細胞表面觀類多角形,有角質(zhì)線紋,油細胞呈類圓形,直徑約為80μm。種皮表皮石細胞長約50μm,直徑為20~30μm,外側(cè)壁較內(nèi)側(cè)壁厚,內(nèi)含棕色或黑色物質(zhì),壁孔及孔溝細小。種皮表皮下石細胞~呈長圓形或類圓形,長徑為50~120μm,短徑為50~60μm,壁厚,壁孔及孔溝明顯。南五味子與北五味子的顯微特征區(qū)別,在于南五味子中果皮細胞中有草酸鈣簇晶(直徑為8~64μm)及方晶(直徑為6~22μm)。
4.3.1 中國藥典
從1995年版到2010年版均采用薄層色譜法對五味子進行鑒別[9]。取五味子粉末、南五味子粉末各1g,加三氯甲烷20mL,加熱回流提取30min,濾過,濾液蒸干,殘渣加三氯甲烷1mL 使溶解,作供試品溶液。另取五味子對照藥材1g,同法制成對照藥材溶液。再取五味子甲素對照品,加三氯甲烷制成每1mL含1mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述3種溶液各2μL,分別點于同一硅膠 FG254薄層板上,以石油醚(30~60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中,在與五味子對照藥材和五味子甲素對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的鮮紅色斑點。汪平等[10]取南北五味子各1.0g,分別加三氯甲烷20mL,水浴回流30min,濾過,濾液水浴蒸干,殘渣加三氯甲烷1mL 使溶解,作供試品溶液。再取五味子甲素、五味子乙素對照品,加三氯甲烷分別制成每1mg含1mL、3mg 含1mL的溶液,作為對照品溶液。按薄層色譜法進行試驗,吸取上述溶液各5μL,分別點于同一硅膠 FG254薄層板上,以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(9∶1)為展開劑,展開約14cm,取出,晾干,置紫外線分析儀(254nm)下檢視。結(jié)果南北五味子藥材的圖譜存在很大差異,南五味子的斑點較北五味子的斑點少,且南五味子藥材圖譜中無五味子乙素對應(yīng)斑點。韓正洲等[11]則采用高效硅膠GF254板,在紫外燈254nm下觀察熒光淬滅點,結(jié)果南五味子薄層圖譜中也無五味子乙素斑點。因此用薄層色譜法很容易鑒別五味子及南五味子。
4.3.2 高效液相法(HPLC)
楊博等[12]用高效液相色譜法測定南、北五味子中5種木脂素成分(五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)的分析方法。以甲醇和水為流動相,采用梯度洗脫,對21個不同產(chǎn)地的南、北五味子樣本進行了色譜分離,并利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、保留時間和紫外光譜對木脂素進行定性。結(jié)果表明,樣品中各組分的色譜峰基本達到基線分離,該方法重復(fù)性好、靈敏度高,為評價南、北五味子中的木脂素活性成分提供了一種可靠的分析方法。汪平等[10]將五味子、南五味子分別研細,過4號篩,取粉末各0.05g,加甲醇25mL,超聲處理30min,濾過,作為供試品溶液,取五味子甲素3.0mg、五味子乙素4.6mg、五味子醇甲2.2mg,分別加甲醇定容至10mL,作為對照品溶液,采用ODS柱,檢測波長254nm,柱溫30℃,流速1mL/min,流動相∶甲醇-水(70∶30),結(jié)果北五味子藥材峰比南五味子的峰多,并且南五味子中沒檢出五味子醇甲、五味子乙素的峰,但檢出五味子甲素的峰。
4.4.1 紫外分光光度法
取五味子、南五味子粉末各0.2g,分別加乙醇40mL,室溫浸泡過夜,吸取上清液1mL,適量稀釋,照紫外分光光度法在250~350nm波長范圍掃描測定,結(jié)果五味子在279nm波長出現(xiàn)一吸收峰,南五味子在粗、此波長處有一肩峰[10]。
4.4.2 熒光光譜法
程秀民等[13]對南、北五味子的極性溶劑和非極性溶劑提取物,分別測定熒光光譜,結(jié)果北五味子和南五味子的極性溶劑提取物光譜,北五味子激發(fā)光譜出現(xiàn)3個峰和3個小肩峰,最大激發(fā)波長為257nm,最大發(fā)射波長為352nm;南五味子激發(fā)光譜出現(xiàn)1個峰和3個肩峰,最大激發(fā)波長為210nm,最大發(fā)射波長為347nm。二者的激發(fā)光譜有較大差異,有鑒別意義。發(fā)射光譜差異較小,不具備鑒別意義。非極性溶劑提取物光譜,北五味子激發(fā)光譜出現(xiàn)1個峰和1個小肩峰,最大激發(fā)波長為341nm;南五味子激發(fā)光譜出現(xiàn)兩個峰,最大發(fā)射波長為31~9nm,區(qū)別較明顯。楊孝容等[14]對五味子的乙醇提取液,采用255、285nm作激發(fā)波長和355、322nm作發(fā)射波長分別進行掃描,根據(jù)發(fā)射光譜的相對強弱和最大發(fā)射波長以及激發(fā)光譜的峰形。結(jié)果表明,安五脂素和五味子乙素具有強熒光性且峰形差異顯著,五味子甲素和五味子醇甲的熒光性較弱,而五味子酯甲不具有熒光性;南北五味子的主要熒光物質(zhì)分別為安五脂素和五味子乙素,據(jù)此可用乙醇提取液的熒光光譜快速鑒別南北五味子。方便地鑒別了南北五味子藥材以及部分含五味子的中藥制劑中五味子的種屬來源;利用高效液相色譜測定了供試品中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和安五脂素的含量,并研究了這5種物質(zhì)的熒光性質(zhì),找出了南北五味子熒光光譜差異的物質(zhì)原因。
4.4.3 紅外光譜法
田進國等[15]取藥材分別用石油醚、乙醚和水提取,提取物經(jīng)溴化鉀壓片,掃描測定紅外光譜。結(jié)果北五味子的光譜與對照藥材在峰的數(shù)目、峰位和峰形都能吻合,僅某些峰的相對強弱有差異。南五味子的光譜輪廊與北五味子的非常相似,這說明其成分大體相似,但是除了某些峰的相對強度有變化外,還出現(xiàn)了幾個新的吸收峰。這些光譜特征可以作為區(qū)別南、北五味子的依據(jù)。
4.5.1 ISSR技術(shù)
ISSR(Inter Simple Sequence Repeats)技術(shù)或稱間插短串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性,是1994年由Zietkiewicz建立的。根據(jù)真核生物基因組中廣泛存在著以1~6個堿基的短核苷酸序列為基本單位的重復(fù)序列的現(xiàn)象,以PCR為基礎(chǔ),采用20個堿基左右的重復(fù)錨定引物擴增基因組中這些重復(fù)序列之間的片段。ISSR技術(shù)是在分子水平上鑒別南、北五味子的一種行之有效的方法。孫岳等[16]采用ISSR技術(shù)對南、北五味子基因組DNA進行PCR擴增。共篩選9條ISSR引條,7個可擴增出PCR產(chǎn)物,4個引物穩(wěn)定性好,帶型清晰,其中S5、S6、S8的擴增產(chǎn)物多態(tài)性高。引物S3在南、北五味子中擴增出相同的條帶,可作為鑒定是否為五味子類藥材的依據(jù)。
4.5.2 隨機擴增多態(tài)DNA技術(shù)
王培訓(xùn)等[17]采用隨機擴增引物DNA(RAPD)法,篩選適于鑒別南、北五味子的隨機引物。總共篩選了80條隨機引物,初步能獲得指紋條帶明顯的引物有15條,但重復(fù)性好、條帶清晰穩(wěn)定的引物只有6條,只得到一條引物S429能準(zhǔn)確區(qū)分南、北五味子,并且其重復(fù)性非常高。南五味子只在600bp有1根條帶,而北五味子在600、400、300bp各有1根條帶,能在各北五味子樣品中共同出現(xiàn)的條帶為400bp??衫秒S機引物S429通過RAPD準(zhǔn)確區(qū)分南、北五味子。
目前關(guān)于藥材的系統(tǒng)聚類與判別分析研究已有報道[18],如能將判別分析函數(shù)應(yīng)用在中成藥中單味藥的鑒別中則將提高鑒別的準(zhǔn)確性。五味子與南五味子市場應(yīng)用廣泛,不僅在中藥配方中以飲片付用,在中藥成方制劑中也有廣泛的應(yīng)用,在中藥配方中兩者的鑒別尚有性狀等傳統(tǒng)鑒別方法可應(yīng)用,而中藥成方制劑中由于中成藥配方的不同,對其中五味子與南五味子的鑒別標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定差異很大,有的還未有規(guī)定。徐愛仁等[19]采用RP-HPLC,以五味子甲素峰為參考峰,色譜柱DIKMADIAMONSILC18柱(4.6mm×150mm,5μm);流動相:甲醇∶水(65∶35);檢測波長254nm,再利用Fisher判別函數(shù)計算。結(jié)果表明,在選定的色譜條件下,對五味子與南五味子進行系統(tǒng)聚類與判別分析,提供了穩(wěn)定可控的液相色譜圖。該方法能夠滿足鑒別五味子與南五味子的要求;采用系統(tǒng)聚類與判別分析和液相色譜技術(shù)鑒別五味子與南五味子是切實可行的。得出結(jié)論則具有準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點。
中國是世界上五味子科植物資源最豐富的國家,全世界該科植物總計50種左右,中國即有28種,已發(fā)現(xiàn)19種科可供藥用?!渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中即將其列為上品,研究結(jié)果表明,現(xiàn)在收入中國藥典的僅北五味子和南五味子兩種,未收入藥典的紅花五味子、內(nèi)南五味子等所含成分與北五味子和南五味子相近,相信隨著對祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥的開發(fā),必將更深入而廣泛地對五味子進行開發(fā)利用。
綜上所述,五味子抗病力強、無不良反應(yīng)、價廉易得、藥源豐富。臨床應(yīng)用非常廣泛,有效成分和作用機制研究日趨完善,鑒別方法日益增多,分析技術(shù)不斷提高,儀器設(shè)備日新月異,從傳統(tǒng)的眼觀口償,到后來的理化分析和目前的色譜、光譜、質(zhì)譜分析及聯(lián)用等,可對其進行更簡便、更有效、專屬性更強檢測。
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