熊中奎， 胡雅兒

(1紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)部，浙江 紹興 223000;2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院細胞調(diào)控實驗室，上海 200025)

α－突觸核蛋白(α－synuclein)是一種腦內(nèi)含量豐富的神經(jīng)蛋白，既參與正常突觸功能的維持，又與各種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者腦內(nèi)，α－突觸核蛋白是多巴胺神經(jīng)元中嗜伊紅染色Lewy小體主要成分。α－突觸核蛋白基因位于染色體4q21.3－q22，均由5個外顯子構(gòu)成。α－突觸核蛋白由140個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約19 kD。根據(jù)估算，α－突觸核蛋白占腦勻漿蛋白含量的1%，在端腦中含量豐富。最初研究認為α－突觸核蛋白與核膜之間存在關(guān)聯(lián)性，而后來的研究發(fā)現(xiàn)它可通過經(jīng)典分泌通路被分布于各種質(zhì)膜上。α－突觸核蛋白分子在自然狀態(tài)下呈伸展狀，其保守的賴氨酸和谷氨酸殘基與兩性端部基團(headgroup)相互作用，而中性基團插入到酰基鏈區(qū)域，使之在質(zhì)膜上呈疏松的卷曲α－螺旋結(jié)構(gòu)，伸展并平行于質(zhì)膜的曲面［1］。

1 生物學(xué)功能

到目前為止，還沒有全面地認識α－突觸核蛋白的生物學(xué)功能，但是現(xiàn)有資料至少表明α－突觸核蛋白具有以下幾種功能:(1)調(diào)節(jié)突觸的可塑性。Golovko等［2］研究發(fā)現(xiàn)α－突觸核蛋白在斑胸草雀(zebra finch)學(xué)習(xí)唱歌的階段表達上調(diào)，而且主要定位于突觸前神經(jīng)末梢，故推測在突觸可塑性和功能方面發(fā)揮重要作用。在體外培養(yǎng)胚胎大鼠海馬神經(jīng)元中，突觸蛋白I(synapsin I)在體外培養(yǎng)的第1 d即可檢測到表達，而α－突觸核蛋白直至培養(yǎng)約5 d時仍然未檢測到，因此認為它可能與突觸的后期發(fā)育及調(diào)節(jié)有關(guān)。(2)整合突觸前信號。通過其脂質(zhì)結(jié)合特性和增強磷脂酶D的活性促進突觸囊泡的形成，α－突觸核蛋白調(diào)節(jié)突觸前神經(jīng)末梢跨膜轉(zhuǎn)運。(3)調(diào)節(jié)突觸處的多巴胺含量。α－突觸核蛋白抑制兒茶酚胺合成限速酶酪－氨酸羥化酶活性。在突觸末端囊泡單胺轉(zhuǎn)運體－2迅速而有效地轉(zhuǎn)運多巴胺，α－突觸核蛋白調(diào)節(jié)多巴胺轉(zhuǎn)運體在細胞膜上穿梭影響多巴胺在神經(jīng)末梢攝取的效率。⑷調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞活性。α－突觸核蛋白敲除小膠質(zhì)細胞再受到刺激后，與對照組比較，前炎癥因子腫瘤壞死因子－α和白細胞介素－6的分泌水平提高。⑸熱休克蛋白樣作用。α－突觸核蛋白的C－端區(qū)域與小熱休克蛋白如α－晶體蛋白相似，能夠保護細胞內(nèi)的蛋白免于變性。α－突觸核蛋白保護細胞免于溫度和氧化應(yīng)激的影響，其C－端刪除導(dǎo)致它對細胞內(nèi)蛋白對抗溫度應(yīng)激的保護作用減弱。研究發(fā)現(xiàn)α－突觸核蛋白的缺失導(dǎo)致Parkin基因敲除所產(chǎn)生的損傷效應(yīng)惡化;另一方面，恢復(fù)正常的α－突觸核蛋白水平可緩解Parkin丟失所致的神經(jīng)毒性。⑹參與脂代謝調(diào)節(jié)。α－突觸核蛋白敲除小鼠的脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)移、代謝過程被干擾，推測其參與細胞內(nèi)脂肪酸的代謝，而且α－突觸核蛋白影響星形膠質(zhì)細胞中脂肪酸的攝取和轉(zhuǎn)運。

2 α－突觸核蛋白與帕金森病

早在1996年意大利的PD家系中首先發(fā)現(xiàn)了α－突觸核蛋白點突變A53T，以后又發(fā)現(xiàn)了A30P和E46K。點突變增加其聚合度，二倍體和三倍體提高表達水平。果蠅轉(zhuǎn)基因突變模型進一步證實了α－突觸核蛋白基因突變與PD的關(guān)系，α－突觸核蛋白基因突變型果蠅成年后出現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元減少，形成含α－突觸核蛋白的包涵體并表現(xiàn)出運動功能障礙。然而與點突變比較，α－突觸核蛋白基因重排在常染色體顯性遺傳性PD中出現(xiàn)的頻率更高［3］。在散發(fā)型PD的研究中未發(fā)現(xiàn)基因突變，α－突觸核蛋白基因多態(tài)性，如啟動子區(qū)，特別是Rep1多態(tài)性重復(fù)序列等位基因以及3’－末端多態(tài)性與散發(fā)性PD的壽命期有關(guān)。

2.1 影響病理性α－突觸核蛋白構(gòu)型水平的因素研究發(fā)現(xiàn)α－突觸核蛋白的多種結(jié)構(gòu)形式如無定型聚集物、寡聚體、原纖維和纖維及其磷酸化、硝基化和泛素化均有神經(jīng)毒性。其中，α－突觸核蛋白纖維由5個β－折疊構(gòu)成，每個原纖維2 nm×3.5 nm，β1→β5兩兩之間一次發(fā)生相互作用［4］。α－突觸核蛋白正常、錯誤折疊及其寡聚化之間存在動態(tài)平衡，當這種平衡被打破后原纖維迅速聚集成大分子、不溶性細纖維進而形成Lewy小體，以避免神經(jīng)元受到更大的損害。然而這種保護作用是短暫的，α－突觸核蛋白的病理性積聚最終導(dǎo)致細胞的凋亡或死亡。

①基因突變。在一項離體實驗中，將野生型、A53T和A30P突變型人α－突觸核蛋白基因?qū)爰毦Ｒ吧秃屯蛔冃挺粒挥|核蛋白在體外培養(yǎng)時都可以形成具有反向平行β－折疊的不溶性原纖維，其中突變型尤其是A53T突變型顯著加快纖維蛋白聚集物的形成。

②分子伴侶功能異常。分子伴侶的作用是保證蛋白質(zhì)的正確折疊與組裝。目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)分子伴侶都屬于熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)家族，如HSP70、HSP40等。在HSP70和α－突觸核蛋白的轉(zhuǎn)基因果蠅模型中發(fā)現(xiàn)雖然對α－突觸核蛋白的包涵體模型無影響，但可明顯緩解多巴胺神經(jīng)元的丟失，而在細胞模型中HSP70的高表達可減少α－突觸核蛋白聚集物的形成。

③泛素蛋白酶體系統(tǒng)的缺陷。體內(nèi)大多數(shù)錯誤折疊、未裝配以及損傷的蛋白質(zhì)的是在泛素標記并被特異性識別后，由泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解清除。在PD家族中發(fā)現(xiàn)泛素羧基端水解酶基因突變造成酶活性下降，出現(xiàn)典型的PD癥狀。當α－突觸核蛋白原纖維的濃度超過26S蛋白酶體的5倍，則可顯著抑制無定形蛋白的非泛素依賴蛋白酶體降解和折疊蛋白的泛素依賴降解。α－突觸核蛋白是蛋白酶體的底物，抑制蛋白酶體的活性則進一步引起α－突觸核蛋白的積累和聚集，最終形成一個惡性循環(huán)［5］。④翻譯后修飾。1)磷酸化修飾。α－突觸核蛋白第129位絲氨酸磷酸化 (pS129)是PD的一個重要特征［6］。體外實驗發(fā)現(xiàn)pS129后比未磷酸化者能夠產(chǎn)生更多寡聚體和不溶性成分。該磷酸化主要由polo樣激酶－2(polo－like kinase－2，PLK2)和PLK3完成的，磷酸化率大于95%，底物識別是通過N－末端重復(fù)序列和(或)NAC區(qū)［25］。第一、在哺乳動物細胞系、原代神經(jīng)元和α－突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的各種亞細胞部分，如細胞質(zhì)、細胞核和細胞膜中均發(fā)現(xiàn)PLKs特異性與pS129共存。第二、PLK2在阿爾采末病患者和Lewy體患者表達水平顯著增加。氧化應(yīng)激和蛋白酶體抑制引起pS129水平增加［7］。而α－突觸核蛋白第125位絲氨酸磷酸化可抑制其寡聚體的形成［8］。2)泛素化修飾。在多巴胺神經(jīng)元中泛素－蛋白異構(gòu)肽連接酶(ubiquitin－protein isopeptide ligase)seven in absentia homolog(SIAH)催化 α －突觸核蛋白的單泛素化修飾促進其聚集［9］。SIAH催化α－突觸核蛋白單泛素化位點有第10、12、21、23、34、43和96位絲氨酸殘基。電鏡下觀察到單泛素化α－突觸核蛋白大量非晶體狀聚集，在體內(nèi)單泛素化增加α－突觸核蛋白包涵體的形成。synphilin－1A抑制SIAH來調(diào)控α－突觸核蛋白的單泛素化及包涵體的形成［10］。3)硝基化和氧化修飾。硝基化和氧化α－突觸核蛋白在包涵體中被檢測到。胞質(zhì)DA尤其是其氧化代謝產(chǎn)物，與α－突觸核蛋白發(fā)生相互作用，使α－突觸核蛋白形成錯誤折疊構(gòu)型，如α－突觸核蛋白蛋氨酸殘基氧化產(chǎn)生二硫鍵導(dǎo)致可溶性寡聚體形成［11］。在PD患者的包涵體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量硝基化α－突觸核蛋白。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，α－突觸核蛋白第125位酪氨酸殘基是硝基化的特異性靶點。硝基化破壞了α－突觸核蛋白正常構(gòu)象，引起蛋白質(zhì)異常集聚。實驗研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞激活釋放的一氧化氮和過氧化物是PD病變中異常的硝基化和氧化α－突觸核蛋白產(chǎn)生的原因［12］。

2.2 病理性α－突觸核蛋白在PD發(fā)病機制中的作用

①干擾脂質(zhì)雙分子層并使之通透性增加，影響突觸囊泡完整性以及胞質(zhì)DA水平。突變型(A30P或A53T)α－突觸核蛋白均可干擾囊泡pH，顯著增加胞質(zhì)中兒茶酚胺，使胞內(nèi)氧化還原損傷趨于惡化。研究發(fā)現(xiàn)A30P、A53T突變以及變異型原纖維α－突觸核蛋白都比野生型對突觸囊泡通透性具有更強的影響。原纖維α－突觸核蛋白誘導(dǎo)的通透性表現(xiàn)出囊泡中低分子量物質(zhì)優(yōu)先漏出的特點，這表明可能是一種微孔樣通透機制。當囊泡膜穩(wěn)定性較差如Ca2+缺乏時，這種通透性對漏出的物質(zhì)更加缺乏分子量上的選擇性，而且單分子態(tài)α－突觸核蛋白即可通過洗滌劑樣作用機制誘導(dǎo)囊泡膜的通透性增強。Danzer等［13］發(fā)現(xiàn)某些寡聚體誘導(dǎo)細胞死亡通過微孔形成機制破壞胞內(nèi)離子平衡，如誘導(dǎo)鈣內(nèi)流，還有部分寡聚體通過直接進入胞內(nèi)引起α－突觸核蛋白積聚增加。Guo等［14］證實上調(diào)α－突觸核蛋白表達可抑制VMAT－2的活力，進一步干擾DA的代謝并導(dǎo)致DA神經(jīng)元的損傷。

②影響胞內(nèi)物質(zhì)運輸功能。第一，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)→高爾基體的囊泡運輸。表達α－突觸核蛋白的酵母菌中出現(xiàn)最早的缺陷是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體囊泡運輸被阻斷。過表達α－突觸核蛋白抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)→高爾基體囊泡運輸，囊泡以出芽方式順利從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出來，但是隨后在特定部位停留并與高爾基體膜融合時被抑制，定位于高爾基體后囊泡的RAB8A和定位于神經(jīng)末梢的RAB3A緩解過表達α－突觸核蛋白所致的神經(jīng)毒性［15］。第二，影響軸漿運輸。研究發(fā)現(xiàn)將α－突觸核蛋白的A30P或A53T點突變基因轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)神經(jīng)元上，神經(jīng)元表現(xiàn)出軸漿運輸減弱，而且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染A30P的神經(jīng)元α－突觸核蛋白易于集聚到胞體。而軸漿運輸?shù)臏p弱可能促進了α－突觸核蛋白的核周集聚、Lewy小體形成和神經(jīng)元的異常改變。Chung等［16］發(fā)現(xiàn)在AAV－α－突觸核蛋白大鼠病理模型紋狀體和黑質(zhì)中，發(fā)生神經(jīng)元丟失之前突觸傳遞和軸漿運輸相關(guān)蛋白發(fā)生明顯變化。紋狀體rabphilin 3A和syntaxin減少。紋狀體內(nèi)順向運輸動力蛋白(KIF1A、KIF1B、KIF2A、KIF3A)降低，而逆向運輸動力蛋白(dynein、dynamitin、dynactin 1)增加。黑質(zhì)內(nèi)HIF1和AHIF2A增加。細胞骨架蛋白發(fā)生急劇改變，actin水平增加而α－微管蛋白和γ－微管蛋白水平降低。

③導(dǎo)致蛋白酶體降解抵抗。過表達血紅素加氧酶－1(heme oxygenase－1，HO－1)可劑量依賴性減少神經(jīng)母細胞瘤M17細胞中α－突觸核蛋白水平并減少其聚集，而不能顯著影響A30P突變型α－突觸核蛋白。當神經(jīng)元暴露于誘導(dǎo)蛋白錯誤折疊的有害刺激下，HO－1觸發(fā)蛋白酶體降解通路，防止胞內(nèi)蛋白聚集及包涵體形成;然而A30P突變型α－突觸核蛋白PD患者表現(xiàn)出對HO－1誘導(dǎo)蛋白酶體降解的抵抗［17］。

④影響吞噬功能。有研究發(fā)現(xiàn)，表達A53T點突變，甚至某些情況下野生型α－突觸核蛋白的神經(jīng)元表現(xiàn)出分子伴侶介導(dǎo)自體吞噬(chaperone mediated autophagy，CMA)功能障礙，后者引起代償性巨型自體吞噬(macroautophagy)，而巨型自體吞噬作為一種損害性反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡［18］。

⑤神經(jīng)炎癥反應(yīng)。硝基化α－突觸核蛋白通過CD4+細胞亞群誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)［19］。Chung等［16］發(fā)現(xiàn)在AAV－α－突觸核蛋白大鼠病理模型紋狀體和黑質(zhì)中，出現(xiàn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，Iba－1激活小膠質(zhì)細胞和前炎癥細胞因子IL－1β、IFN－γ和TNF－α水平增加。

⑥影響組蛋白乙?；ｓw外實驗中A30P和A53T突變增加α－突觸核蛋白進入細胞核的比例。進入細胞核的α－突觸核蛋白產(chǎn)生毒性，而保留在細胞質(zhì)中的α－突觸核蛋白具有保護作用。α－突觸核蛋白的毒性通過給予組蛋白去乙?；敢种苿┙獬＆粒挥|核蛋白直接結(jié)合到組蛋白上，降低乙?；M蛋白H3水平并抑制乙酰化作用。

⑦tau蛋白過度磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)12個月齡A53T突變型轉(zhuǎn)基因小鼠的突觸部位發(fā)現(xiàn)tau蛋白第396位絲氨酸異常磷酸化，α－突觸核蛋白激活糖原合成酶激酶 －3β(glycogen synthase kinase－3β，GSK －3β)，后者催化 tau 蛋白的過度磷酸化［20］。

事實上，許多具有重要生理功能的蛋白質(zhì)在特定條件下也會表現(xiàn)出毒性作用。一般認為超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)對氧化應(yīng)激具有保護作用，然而SOD的過度表達也可產(chǎn)生神經(jīng)損傷，這一點體現(xiàn)在肌萎縮脊髓側(cè)索硬化癥上。迄今α－突觸核蛋白的功能還未完全了解，但是很多證據(jù)表明正常α－突觸核蛋白在細胞內(nèi)具有多種重要生物學(xué)功能，而過度表達、異常修飾或者突變α－突觸核蛋白會對細胞產(chǎn)生顯著病理性損傷作用［21］。

［1］Jao CC，Hegde BG，Chen J，et al.Structure of membrane－bound alpha－synuclein from site－directed spin labeling and computational refinement［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(50):19666－19671.

［2］Golovko MY，Barceló－ Coblijn G，Castagnet PI，et al.The role of alpha－synuclein in brain lipid metabolism:a downstream impact on brain inflammatory response［J］.Mol Cell Biochem，2008，326(1－2):55－66.

［3］Ibanez P，Lesage S，Janin S，et al.Alpha－ synuclein gene rearrangements in dominantly inherited parkinsonism:frequency，phenotype，and mechanisms［J］.Arch Neurol，2009，66(1):102 －108.

［4］Vilar M，Chou HT，Lührs T，et al.The fold of alphasynuclein fibrils［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(25):8637－8642.

［5］Zhang NY，Tang Z，Liu CW.Alpha－synuclein protofibrils inhibit 26 S proteasome－mediated protein degradation:understanding the cytotoxicity of protein protofibrils in neurodegenerative disease pathogenesis［J］.J Biol Chem，2008，283(29):20288－20298.

［6］Mbefo MK，Paleologou KE，Boucharaba A，et al.Phosphorylation of synucleins by members of the polo－like kinase family［J］.J Biol Chem，2010，285(4):2807 －2822.

［7］Chau KY，Ching HL，Schapira AH，et al.Relationship between alpha synuclein phosphorylation，proteasomal inhibition and cell death:relevance to Parkinson’s disease pathogenesis［J］.J Neurochem，2009，110(3):1005 －1013.

［8］Chen L，Periquet M，Wang X，et al.Tyrosine and serine phosphorylation of alpha－synuclein have opposing effects on neurotoxicity and soluble oligomer formation［J］.J Clin Invest，2009，119(11):3257 －3265.

［9］Rott R，Szargel R，Haskin J.Monoubiquitylation of alpha－synuclein by seven in absentia homolog(SIAH)promotes its aggregation in dopaminergic cells［J］.J BiolChem，2008，283(6):3316－3328.

［10］Szargel R，Rott R，Eyal A，et al.Synphilin－1A inhibits seven in absentia homolog(SIAH)and modulates alphasynuclein monoubiquitylation and inclusion formation［J］.J Biol Chem，2009，284(17):11706－11716.

［11］Leong SL，Pham CL，Galatis D，et al.Formation of dopamine－mediated alpha－synuclein－soluble oligomers requires methionine oxidation［J］.Free Radic Biol Med，2009，46(10):1328－1337.

［12］Gao HM，Kotzbauer PT，Uryu K，et al.Neuroinflammation and oxidation/nitration of alpha－synuclein linked to dopaminergic neurodegeneration［J］.J Neurosci，2008，28(30):7687－7698.

［13］Danzer KM，Haasen D，Karow AR，et al.Different species of alpha－synuclein oligomers induce calcium influx and seeding［J］.J Neurosci，2007，27(34):9220 －9232.

［14］Guo JT，Chen AQ，Kong Q，et al.Inhibition of vesicular monoamine transporter－2 activity in alpha－synuclein stably transfected SH －SY5Y cells［J］.Cell Mol Neurobiol，2008，28(35－47):35－47.

［15］Gitler AD，Bevis BJ，Shorter J，et al.The Parkinson’s disease protein alpha－synuclein disrupts cellular Rab homeostasis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(1):145－150.

［16］Chung CY，Koprich JB，Siddiqi H，et al.Dynamic changes in presynaptic and axonal transport proteins combined with striatal neuroinflammation precede dopaminergic neuronal loss in a rat model of AAV alpha－synucleinopathy［J］.J Neurosci，2009，29(11):3365 －3373.

［17］Song W，Patel A，Qureshi HY，et al.The Parkinson disease－associated A30P mutation stabilizes alpha－synuclein against proteasomal degradation triggered by heme oxygenase－1 over－expression in human neuroblastoma cells［J］.J Neurochem，2009，110(2):719 －733.

［18］Xilouri M，Vogiatzi T，Vekrellis K，et al.Abberant alpha－synuclein confers toxicity to neurons in part through inhibition of chaperone － mediated autophagy［J］.PLoS One，2009，4(5):e5515.

［19］Reynolds AD，Stone DK，Mosley RL，et al.Nitrated{alpha}－synuclein－induced alterations in microglial immunity are regulated by CD4+T cell subsets［J］.J Immunol，2009，182(7):4137－4149.

［20］Duka T，Duka V，Joyce JN，et al.Alpha － Synuclein contributes to GSK－3 beta－catalyzed Tau phosphorylation in Parkinson’s disease models［J］.FASEB J，2009，23(9):2820－2830.

［21］陶思祥，張國華，徐 杰，等.利福平對魚藤酮處理的大鼠多巴胺神經(jīng)元的保護作用［J］.中國病理生理雜志，2008，24(9):1751－1756.