吳丹丹， 汪慧英

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院1感染性疾病科，2變態(tài)反應(yīng)科，杭州 浙江 310009)

分化抗原簇 69(cluster of differentiation 69，CD69)于1981年發(fā)現(xiàn)，早期被稱為活化誘導(dǎo)分子(activation inducer molecule，AIM)，早期活化抗原－1(early activation antigen－l，EA －1)等，是 C － 型凝集素受體家族的成員，CD69基因?qū)儆谧匀粴?xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因復(fù)合體家族，在細(xì)胞的生物功能調(diào)節(jié)中起著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。初始的研究證實CD69在細(xì)胞的活化中起著重要的促進(jìn)作用。近年來的研究顯示，CD69的表達(dá)在促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步活化的同時，還可能與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)［1］。本文就CD69在細(xì)胞活化和凋亡過程中的這一雙向免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行綜述。

1 CD69的分子結(jié)構(gòu)和基因定位

對CD69的分子結(jié)構(gòu)研究顯示:CD69是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，由199個氨基酸組成，包括40個殘基的細(xì)胞內(nèi)區(qū)，21個殘基的跨膜區(qū)和138個殘基的細(xì)胞外區(qū)。細(xì)胞外區(qū)有特征性的Ca2+依耐性糖基識別區(qū)域。CD69通常以同源二聚體形式存在，由分子量為28 kD和32 kD的2條鏈經(jīng)二硫鍵連接，這2條鏈由分子量為22.5 kD的多肽鏈通過不同的糖基化組成。每條鏈細(xì)胞外區(qū)有1個位于第166個氨基酸位置的N端連接的糖基化位點，提示糖基化鏈的遺傳異質(zhì)性，但此遺傳異質(zhì)性的結(jié)構(gòu)和功能的重要意義尚不清楚。CD69在細(xì)胞表面表達(dá)均為磷酸化形式［2］，這對它與其它細(xì)胞表面的蛋白分子連接很重要。CD69在細(xì)胞的生物功能中起著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。

小鼠與人的CD69有58%的同源性，也是由199個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。不同的是鼠的CD69有3個N端連接的糖基化位點，其中的一個與人的高度同源。CD69基因?qū)儆贜K細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因復(fù)合體家族，人的CD69基因與NKG2基因叢相近，而后者在NK細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶向識別中有重要作用。不同的是，自然殺細(xì)胞受體蛋白1(natural killer cell receptor protein 1，NKP－P1)、NK細(xì)胞的抑制性受體Ly49與NK細(xì)胞活化性受體NKG2分子只表達(dá)在NK細(xì)胞上，而CD69可在多種細(xì)胞上表達(dá)。說明CD69有不同于這三者的特性。人的CD69基因位于12號染色體的短臂12p12.3－p13.2區(qū)，鼠的CD69基因位于6號染色體長臂的遠(yuǎn)端。小鼠的CD69基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，該基因由5個跨越7.5 kb的外顯子組成，第1、2外顯子分別編碼細(xì)胞漿和跨膜區(qū)，第3－5外顯子編碼CRD。

2 CD69在細(xì)胞活化中的作用

CD69自被發(fā)現(xiàn)后，其初始研究基本上是關(guān)于它在細(xì)胞活化中的作用。CD69可在幾乎所有髓系細(xì)胞中表達(dá)。但除了在血小板和單核細(xì)胞中有持續(xù)的低水平表達(dá)外，CD69在其它細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)下并不表達(dá)，而是在細(xì)胞激活后表達(dá)。早期的研究主要集中于它在 T細(xì)胞和 NK細(xì)胞中的表達(dá)［3，4］。靜止的 T細(xì)胞或NK細(xì)胞一般不表達(dá)CD69，通過T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)接受CD3/TCR復(fù)合物、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)、蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)激活物佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate，PMA)等刺激信號，1 h后細(xì)胞表面即有CD69的表達(dá)，此后CD69的表達(dá)迅速達(dá)到高峰，并可持續(xù)至72 h。但不同的刺激物誘導(dǎo)CD69表達(dá)的峰值時間有所不同。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞在PMA、抗IgM或金黃色葡萄球菌Cowan I(SAC)的刺激下也可表達(dá)CD69。中性粒細(xì)胞亦可在PAM刺激后表達(dá)CD69。對于CD69在嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，Eos)表面的表達(dá)研究較少，直至1995年研究者利用國際第五工作室提供的473種人類白細(xì)胞抗體對人Eos表面抗原進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)靜止的外周血Eos表面并不表達(dá)CD69，而體外粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte－macrophage colonystimulating factor，GM －CSF)、白細(xì)胞介素 －5(interleukin－5，IL－5)培養(yǎng)后的Eos及哮喘患者支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)中Eos均有CD69的表達(dá)［5］。其它實驗顯示體外細(xì)胞因子可誘導(dǎo)外周血 Eos表達(dá) CD69，其中 IL－4、IL－13與腫瘤壞死因子－γ(tumor necrosis factor－γ，TNF－γ)有協(xié)同作用［6］。研究亦顯示小鼠Eos佛波醇乙酯PMA等作用下1 h即有CD69的表達(dá)，在18 h 到高峰［7］。Yamamoto 等［8］進(jìn)一步研究其表達(dá)機制，利用培養(yǎng)的單層人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，以IL－1β刺激其表達(dá)細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1)，哮喘患者外周血Eos通過該上皮層后有CD69、人白細(xì)胞DR抗原［human leukocyte antigen(locus)DR，HLA －DR］、ICAM －1表達(dá)顯著增加及存活率顯著增高。CD69的這種僅在不同細(xì)胞活化后表達(dá)的特性，使得它在許多研究中被作為細(xì)胞活化的標(biāo)記分子。

CD69在以上這些細(xì)胞中的表達(dá)均為早期活化階段。早期CD69的快速表達(dá)可能依賴于細(xì)胞內(nèi)存儲的CD69蛋白，而此后的持續(xù)表達(dá)則需要RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成。誘導(dǎo)CD69表達(dá)的機制主要是PKC的激活和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的持續(xù)增高［9］，阻斷PKC通路可直接抑制CD69的表達(dá)［10］。后兩者可作用于Ras蛋白，Ras蛋白與三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)連接，是一個重要的細(xì)胞內(nèi)信號分子，而最近的研究顯示Ras－GTP偶合蛋白不僅可促進(jìn)活化信號Akt，MEK(絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶激酶，MAPK/ERK激酶)，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)磷酸化，是CD69表達(dá)所必需的條件［11］。

CD69在活化細(xì)胞中的快速表達(dá)并不僅僅作為一個標(biāo)記分子，事實上，它更重要的作用是作為細(xì)胞共刺激信號進(jìn)一步增強細(xì)胞的活化或增殖分化。首先，CD69的表達(dá)可介導(dǎo)細(xì)胞激活后細(xì)胞因子的合成，如CD69+T細(xì)胞可有 IL－12β、IL－18α 和IL－16β mRNA水平增高，并在重組IL－12或IL－18的作用下有干擾素 － γ(interferon－ γ，IFN － γ)的產(chǎn)生［12］;由于缺乏明確的體內(nèi)CD69配體，抗CD69mAb常用于分析CD69的作用。在刺激物如PMA的存在下，抗CD69 mAb可刺激T細(xì)胞分泌IL－2，進(jìn)一步加快增殖，誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)，血小板細(xì)胞脫顆粒激活花生四烯酸代謝?？笴D69mAb可影響由IL－2激活的NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的裂解作用。Eos表面CD69的表達(dá)與GM－CSF的自分泌密切相關(guān)。Dallaire等［13］亦發(fā)現(xiàn)Eos通過單層內(nèi)皮細(xì)胞后即有CD69表達(dá)，并伴白三烯C4的釋放增加。

CD69的這種細(xì)胞活化作用的機制并不明確。雖然CD69分子的胞內(nèi)區(qū)非常短，且未有可識別的功能相關(guān)殘基，尚未明確與其胞內(nèi)分子相連的信號蛋白。但近來的研究顯示CD69在NK細(xì)胞中可能激活Src通路中的Syk蛋白［14］。也有報道稱CD69在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中可通過偶合G蛋白來起作用。其確切機制這有待探討。

3 CD69在細(xì)胞凋亡中的作用

雖然CD69在細(xì)胞活化中的有著重要作用，但近年來的研究顯示，CD69的表達(dá)在體內(nèi)與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。在體內(nèi)活化的具有CD69高表達(dá)的T細(xì)胞在體外易于快速自發(fā)凋亡［15］，CD69－/－小鼠腹腔和脾中淋巴細(xì)胞存活率增高，凋亡明顯減少，脾淋巴細(xì)胞在激活后的凋亡明顯低于野生型小鼠，并有凋亡信號caspase－3的活化減少［16］。研究發(fā)現(xiàn)PMA刺激后CD69高表達(dá)的Eos亦有凋亡的顯著增加;國外有人在Eos體外培養(yǎng)時，加入antiCD69mAb可增加細(xì)胞凋亡，伴有抗凋亡信號B細(xì)胞淋巴瘤/白血?。?(B －cell leukemia－lymphoma，bcl－2)表達(dá)下降的報道［17］，且CD69與抗體的交聯(lián)所誘導(dǎo)的Eos凋亡并不受周圍環(huán)境中GM－CSF的影響［18］。

與死亡受體CD95相比，CD69介導(dǎo)的凋亡有其自己的特點［17］，CD95介導(dǎo)的凋亡幾乎涉及所有細(xì)胞類型，而明確可由CD69介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞主要為活化的嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。另外，CD95在靜止細(xì)胞及活化細(xì)胞上均可表達(dá)，因此CD95誘導(dǎo)的凋亡與細(xì)胞活化狀態(tài)無關(guān);而CD69在大多數(shù)靜止、非活化的髓系細(xì)胞中無表達(dá)，僅在血小板和單核細(xì)胞中有結(jié)構(gòu)性表達(dá)。CD69誘導(dǎo)的凋亡可選擇性作用于被活化后的細(xì)胞，而對于非活化細(xì)胞則無此作用。以嗜酸性粒細(xì)胞為例，CD69在許多變態(tài)反應(yīng)性疾病中，可作為嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的一個理想死亡受體，它可誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)炎癥部位聚集的活化嗜酸性細(xì)胞凋亡，從而改善局部炎癥，但對于外周血中未活化的嗜酸性粒細(xì)胞則無此影響。因此，與CD95相比，以CD69作為誘導(dǎo)凋亡的靶目標(biāo)副反應(yīng)更小。另一方面，根據(jù)細(xì)胞種類的不同，CD69的作用具有多面性，如增加IgM抗體刺激后的B細(xì)胞增殖，增加單核細(xì)胞NO生成，活化單核細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。目前尚未有抗CD69單抗對其它表達(dá)CD69的細(xì)胞(如T或B淋巴細(xì)胞)誘導(dǎo)凋亡的報道，但很可能是其誘導(dǎo)凋亡的路徑尚未發(fā)現(xiàn)。

關(guān)于CD69介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機制仍不明確。研究顯示CD69介導(dǎo)的單核細(xì)胞凋亡與3個不同的信號通路相關(guān)［19］:(1)依賴于NO;(2)與磷脂酶A2/磷脂氧化酶級聯(lián)反應(yīng)相關(guān);(3)受百日咳毒素(PTX)敏感的G蛋白影響，且三者都是誘導(dǎo)單核吞噬細(xì)胞凋亡的必要不充分條件。此外，TGF－β可能在其中起一定的作用［16］。以膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)為例［20］，CD69 缺陷鼠可因 T細(xì)胞和B細(xì)胞對膠原過度反應(yīng)而導(dǎo)致CIA的急性發(fā)作，而此急性發(fā)作與炎癥關(guān)節(jié)中TGF－β水平的降低相關(guān)。而抗TGF－β抗體在野生型小鼠中可加重CIA的嚴(yán)重程度，使得炎癥細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌增加，但對CD69缺陷小鼠卻無此作用。在NK細(xì)胞敏感的腫瘤模型中，CD69缺陷鼠中免疫細(xì)胞分泌TGF－β明顯減少并導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡減少，從而增強了抗腫瘤的能力［21］。以上這些研究提示CD69可能通過介導(dǎo)TGF－β的合成來調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。

此外，CD69的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)機制本身也存在其誘導(dǎo)凋亡作用的分子基礎(chǔ)。CD69可與凋亡信號分子鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin)的N末端相連接也提示CD69可能在細(xì)胞凋亡中起著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［2］;CD69的表達(dá)依賴PKC的激活和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的持續(xù)升高，而PKC激活、胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高都與細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切聯(lián)系。此外，CD69高表達(dá)的T細(xì)胞可測到Fas的表達(dá)增加［22］，后者也是細(xì)胞凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。另外，antiCD69mAb可下調(diào)抗凋亡基因bcl－2的表達(dá)，同樣是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的一個重要機制。

綜上所述，CD69不僅在細(xì)胞的活化中起著重要的促進(jìn)作用，它與細(xì)胞活化后的凋亡也有著密切聯(lián)系。

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