張馨月,冉多良,葉偉成,袁秀芳,王一成,劉蔓雯,張 存*

(1.浙江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,浙江杭州310021;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊830052)

鴨瘟(Duck enteritis)是由鴨瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鴨、鵝、雁及其他雁形目禽類的急性、敗血性、高度致死性傳染病,其特點(diǎn)是流行廣泛,傳播迅速,發(fā)病率和死亡率高[1-2],給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。鴨瘟病毒屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科,衣殼為20面體對稱,有囊膜。鴨瘟病毒的DNA具典型的皰疹病毒DNA的特征,基因組為線狀雙股DNA,大小約為150 kb[3]。近年來,鴨瘟病毒基因研究取得了顯著的進(jìn)展,TK、UL24、gH、gD、UL6等基因的序列陸續(xù)得到克隆和測序[2]。

α皰疹病毒可以作為活的病毒載體,病毒基因組大,有廣泛的非必需區(qū)存在,其中TK基因就是一個(gè)常用的非必需區(qū),在TK基因內(nèi)部插入外源基因能夠得到有效的表達(dá)。重組α-皰疹病毒已經(jīng)成為研究動物多價(jià)重組病毒疫苗的重要手段,成功建立了多種動物的皰疹病毒載體系統(tǒng),如豬偽狂犬病病毒(PRV)、雞馬立克病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)[2-5],而鴨瘟病毒在這一領(lǐng)域的研究尚屬空白。本文構(gòu)建了以TK基因及其相鄰UL24基因序列為同源重組臂、用Pcmv啟動子控制外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體pTK-GFP,為研究重組鴨瘟病毒和構(gòu)建具有遺傳標(biāo)記的鴨瘟弱毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒載體、工程菌 pMD18-T載體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;pADtrack質(zhì)粒及E.coli宿主菌TOP10由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 細(xì)胞和病毒 按常規(guī)方法取9日齡～10日齡SPF雞胚(購自山東省農(nóng)科院家禽所)制備雞胚成纖維細(xì)胞單層,增殖DEV強(qiáng)毒和疫苗毒。DEV強(qiáng)毒株京A購自中監(jiān)所,弱毒株為疫苗毒(上海松江生物制品廠)。

1.1.3 酶和試劑 p fu酶、Ex Taq酶、蛋白酶K、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、K lenow聚合酶、pMD18-T克隆載體、DNA膠回收試劑盒等,為寶生物工程(大連)有限公司和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

LipofectamineTM2000脂質(zhì)體和MEM為Invitrogen公司產(chǎn)品。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組的提取 按文獻(xiàn)[3]方法提取鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和疫苗株基因組DNA。

1.2.2 鴨瘟病毒TK基因的克隆和序列分析

1.2.2.1 鴨瘟病毒TK基因的擴(kuò)增和克隆 根據(jù)GenBank中收錄的DEV TK和UL24基因序列(序列號AY911509),設(shè)計(jì)1對引物,可以擴(kuò)增TK基因全長和UL24基因5′端982 bp的片段,P1:5′-TCAATTAATTGTCATCTCGGTATTG-3′;P2:5′-CAGTTGCATTGCCGTGTGGTA-3′。

Ex Taq酶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳切膠回收目的DNA條帶,按試劑盒操作說明書直接連接克隆到pMD18-T載體中。以Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒,分別命名為pMDT-TK(弱毒)和pMDT-TKV(強(qiáng)毒),并送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2.2 鴨瘟病毒TK基因的序列分析 用DNA Star軟件對測序的鴨瘟強(qiáng)弱毒TK基因序列進(jìn)行比較分析,同時(shí)將所測的序列與Gen Bank中的鴨瘟病毒TK基因序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.3 TK基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

1.2.3.1 重組臂的克隆 以pMDT-TK為模板,以p fu酶和引物P1、P2擴(kuò)增TK-UL24基因DNA片段,凝膠電泳回收約2.0 kb DNA片段,pUC18載體以Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切后補(bǔ)平末端。按常規(guī)方法連接、轉(zhuǎn)化、酶切鑒定,篩選重組質(zhì)粒pTK。1.2.3.2 Pcmv-GFP-pA真核表達(dá)盒的擴(kuò)增和克隆根據(jù)公開發(fā)表的pADtrack DNA序列設(shè)計(jì)一對引物,分別位于Pcmv啟動子的上游和polyA下游,可以擴(kuò)增出Pcmv-GFP-polyA完整的基因表達(dá)盒,P3:5′-ATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAA-3′;P4:5′-TTTGGATCCTTATATATTCTTTCCCACCCTTA -3′,其中下游引物中包含了Bam HⅠ酶切位點(diǎn)。

p fu酶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳切膠回收目的DNA條帶,BamHⅠ酶切回收;pTK質(zhì)粒以XhoⅠ酶切后K lenow聚合酶補(bǔ)平末端,再以Bam HⅠ酶切,切膠回收載體大片段。按常規(guī)方法,連接、轉(zhuǎn)化、酶切鑒定和測序驗(yàn)證,篩選重組質(zhì)粒pTK-GFP。

1.2.3.3 重組質(zhì)粒pTK-GFP大量提取 轉(zhuǎn)移載體pTK-GFP和pTK質(zhì)粒的大量提取采用聚乙二醇沉淀法純化,方法參見文獻(xiàn)[4]。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)或鴨胚腎細(xì)胞(DK),待95%細(xì)胞鋪滿孔底時(shí),按說明書進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染。將適量DNA及脂質(zhì)體分別溶于一定量的OPTIMEM無血清營養(yǎng)液中,將兩者混勻,室溫作用20 min,形成脂質(zhì)體復(fù)合物,加入以無血清MEM培養(yǎng)液洗滌3次后細(xì)胞單層,37℃靜置培養(yǎng)6 h后換MEM維持液。用上述方法分別轉(zhuǎn)染pTK-GFP和pTK兩種質(zhì)粒,同時(shí)設(shè)沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作對照。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 DEV強(qiáng)弱毒株TK基因PCR擴(kuò)增和克隆

用設(shè)計(jì)的一對引物,采用PCR方法從鴨瘟強(qiáng)、弱毒株基因組中各擴(kuò)增出一條約2 kb DNA片段,與預(yù)期結(jié)果1 995 bp相一致,其瓊脂糖電泳結(jié)果見圖1。DEV強(qiáng)、弱毒TK基因PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體后,重組質(zhì)粒用Eco RⅠ/Hin dⅢ雙酶切鑒定,結(jié)果均切出兩條DNA條帶,一條約2 kb,是插入的TK基因,另一條約2.6 kb是載體片段。

2.2 鴨瘟病毒TK基因序列比較分析

對DEV弱毒株TK基因和U L24基因5′端982 bp序列(GenBank登錄號:EF053033)和強(qiáng)毒株進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)其序列完全相同。其與Gen-Bank登錄的其他3株DPV毒株TK基因序列(登錄號AY911509、四川AY 963569、四川DQ640611)相比,核苷酸的同源性分別為99.5%、99.9%和100%,推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性,分別為98.6%、99.4%和100%。對DEV強(qiáng)、弱毒株UL24基因5′端982 bp DNA序列與GenBank收錄的DQ227739、AY 911511相比較,核苷酸同源性分別為99.8%和100%,氨基酸同源性均為100%。這說明DEV TK和U L24基因具有高度的保守性。

2.3 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

2.3.1 TK基因的亞克隆和鑒定 pUC18質(zhì)粒經(jīng)Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切后補(bǔ)平末端,與p fu酶擴(kuò)增的TK基因平端連接后獲得陽性克隆,重組質(zhì)粒pTK經(jīng)Eco RV、Sa lⅠ雙酶切,可以獲得1.3 kb和3.3 kb兩條DNA片段,圖2顯示的瓊脂糖電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符,表明TK基因已插入到pUC載體中,重組質(zhì)粒命名為pTK。

圖1 DEV強(qiáng)弱毒株TK基因PCR產(chǎn)物鑒定Fig.1 PCR productsof TK gene from DEV of virulent isolate and vaccine strain

圖2 重組質(zhì)粒pTK電泳Fig.2 Electrophoresisof recombinant plasmid pTK

2.3.2 GFP基因表達(dá)盒的克隆與鑒定 從質(zhì)粒pAdtrack中成功擴(kuò)增出約1.8 kb左右的DNA片段,經(jīng)Bam HⅠ酶切后克隆于pTK質(zhì)粒Bam HⅠ和XhoⅠ位點(diǎn),獲得的陽性重組質(zhì)粒pTK-GFP以Eco RV酶切鑒定,切出約2 kb左右片段,DNA序列測定(測序結(jié)果未顯示)表明GFP表達(dá)盒與源序列完全一致,證明Pcmv-GFP-pA基因表達(dá)盒已經(jīng)成功克隆入pTK質(zhì)粒中(圖3)。

2.4 轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)移載體pTK-GFP以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)和鴨腎細(xì)胞(DK)8 h后,熒光顯微鏡下觀察,可見到大量發(fā)出亮綠色熒光的細(xì)胞(見圖4A,圖4C)。圖片顯示這些細(xì)胞成多對出現(xiàn),或多個(gè)發(fā)光細(xì)胞聚集在一起。而未插入GFP表達(dá)盒的質(zhì)粒pTK(見圖4B,圖4D)和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞(圖片未顯示)沒有見到綠色熒光,表明pTK-GFP質(zhì)粒攜帶的GFP基因可以在DEF和DK細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)。

圖3 重組質(zhì)粒pTK-GFP電泳Fig.3 Electrophoresis of recombinant plasm id p TK-GFP

圖4 pTK-GFP及pTK轉(zhuǎn)染細(xì)胞后GFP表達(dá)結(jié)果Fig.4 Expression of p TK-GFP and pTK transfected in to duck embryo cells

3 討論

皰疹病毒TK基因編碼胸腺嘧啶激酶,是一種重要的毒力基因,為皰疹病毒復(fù)制的非必需基因。重組α皰疹病毒研究表明,皰疹病毒TK基因高度保守[5]。本研究通過鴨瘟強(qiáng)弱毒株TK基因及相鄰UL24基因克隆、測序及分析,鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株TK基因和U L24基因5′端982 bp核苷酸序列均完全一致,與其他鴨瘟病毒毒株TK基因及UL24基因5′端982 bp核苷酸序列進(jìn)行比較,同源性98.6%以上,表明鴨瘟病毒TK基因高度保守。試驗(yàn)用的DEV疫苗弱毒株是強(qiáng)毒株通過雞胚和細(xì)胞連續(xù)傳代培育而成,說明鴨瘟病毒TK基因在致弱過程中沒有變化,鴨瘟病毒的毒力強(qiáng)弱與TK基因編碼序列沒有直接的關(guān)系。

目前已成功建立了多種α皰疹病毒重組病毒系統(tǒng),TK基因是構(gòu)建重組皰疹病毒最常用的外源基因插入位點(diǎn),國內(nèi)外多位研究者[6-8]先后構(gòu)建了TK基因缺失的重組偽狂犬病、雞傳染性喉氣管炎等病毒轉(zhuǎn)移載體。鴨瘟病毒轉(zhuǎn)移載體方面的研究目前尚未見報(bào)道,本文以鴨瘟病毒TK基因作為外源基因的插入位點(diǎn)構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體,將為進(jìn)一步獲得重組鴨瘟病毒奠定基礎(chǔ)。

構(gòu)建病毒載體疫苗時(shí),外源基因?qū)氩《净蚪M通常采用具有同源重組臂的轉(zhuǎn)移載體與基因組DNA同源重組實(shí)現(xiàn)。同源重組已被證實(shí)是將外源基因?qū)氲囊环N十分有效的方法[9]。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒同源重組臂應(yīng)該長到150 bp[10],偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體兩臂在0.8 kb～1.42 kb之間具有較高的整合效率[11-13]。本研究中所構(gòu)建的鴨瘟病毒TK基因轉(zhuǎn)移載體pTK-GFP,以鴨瘟病毒疫苗弱毒株TK和UL24基因?yàn)橥凑媳?缺失了TK基因的5′端核苷酸序列,同源重組臂分別為835 bp和840 bp,利于病毒在細(xì)胞內(nèi)的重組。

CMV啟動子是一種強(qiáng)啟動子,在多種真核細(xì)胞中均能啟動mRNA的轉(zhuǎn)錄,表達(dá)效率高[14-17]。本研究中所構(gòu)建的鴨瘟病毒TK基因轉(zhuǎn)移載體,攜帶綠色熒光蛋白真核表達(dá)盒,轉(zhuǎn)染DEFs和DK細(xì)胞,GFP均可得到有效的表達(dá),表明CMV啟動子為鴨源細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子所識別,可以作為啟動子應(yīng)用于鴨重組病毒的構(gòu)建。GFP可在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光,近年來成為生物化學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用的標(biāo)記物[18]。GFP作為一種基因報(bào)告分子,對細(xì)胞沒有傷害性,可應(yīng)用于活體,及時(shí)的檢測基因表達(dá)。鴨瘟病毒轉(zhuǎn)移載體以GFP作為篩選標(biāo)記,方便病毒重組方法的建立和重組病毒的篩選。

鴨瘟病毒作為水禽應(yīng)用最廣泛的疫苗,作為一種皰疹病毒,DEV可以成為一種良好的疫苗載體,鴨瘟病毒TK基因轉(zhuǎn)移載體的成功構(gòu)建,將為進(jìn)一步開展鴨瘟病毒載體的研究和構(gòu)建具有遺傳標(biāo)記的鴨瘟疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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