倪沛佩,楊玉榮,梁宏德

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南鄭州 450002)

Balb/c小鼠因其敏感性好、世代間隔短,可供營(yíng)養(yǎng)、遺傳、疾病、組織、胚胎、繁殖、藥理等學(xué)科方面的試驗(yàn)和研究,是一種很好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1]。有關(guān)小鼠中耳和內(nèi)耳的文獻(xiàn)較多,但關(guān)于小鼠耳廓組織結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。在全世界范圍內(nèi),人耳廓再造手術(shù)是對(duì)整形外科醫(yī)生的挑戰(zhàn),目前仍以肋軟骨移植為再造的主體步驟。因此,研究小鼠耳廓組織學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)于人耳廓再造的研究有一定的借鑒意義。本試驗(yàn)通過(guò)制作常規(guī)石蠟切片,HE染色,顯微鏡下觀察小鼠耳廓組織學(xué)結(jié)構(gòu),增加對(duì)小鼠皮脂腺和軟骨細(xì)胞的認(rèn)識(shí)和了解,豐富哺乳動(dòng)物比較組織學(xué)內(nèi)容,可為進(jìn)一步研究小鼠耳廓疾病的診斷、預(yù)防以及耳廓疾病模型的建立提供一定組織學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Balb/c小鼠(9周齡)10只,雌雄各5只,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠耳廓取材及固定 麻醉致死后取耳廓置于100mL/L福爾馬林中固定48 h。

1.2.2 切片及染色 常規(guī)石蠟切片及HE染色。

1.2.3 組織觀察 置于Leica DM 2000顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

Balb/c小鼠耳廓組織結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)分為表皮、真皮、皮下組織、軟骨層四層結(jié)構(gòu)。

2.1 表皮

表皮由復(fù)層扁平上皮組成,這種結(jié)構(gòu)在耳廓橫切面的中央部位明顯可見(jiàn)。從外至內(nèi)可見(jiàn)角質(zhì)層、顆粒層、棘細(xì)胞層、基層(圖1)。

角質(zhì)層由大量角化的扁平細(xì)胞構(gòu)成,胞核幾乎已消失。顆粒層由2層～3層梭形細(xì)胞構(gòu)成,染色呈紫藍(lán)色,胞核深染、固縮。棘細(xì)胞層由4層～5層多邊形細(xì)胞組成。棘細(xì)胞層的淺層細(xì)胞逐漸變?yōu)楸馄??；鶎邮亲羁拷嫫さ囊粚蛹?xì)胞,呈低柱狀,具有卵圓形的細(xì)胞核。

表皮向耳廓緣逐漸變薄,至耳緣處已變?yōu)?層～3層細(xì)胞構(gòu)成(圖2)。

2.2 真皮

真皮由大量的彈性纖維組成,細(xì)胞成分較少,可見(jiàn)較小的血管和淋巴管,血管管壁不易辨認(rèn)(圖3)。真皮淺層由較致密的結(jié)締組織構(gòu)成,這些結(jié)締組織與表皮的基膜相接處,形成一些乳頭狀突起,但乳頭較小。真皮深層存在豐富的彈性纖維,其與表皮的表面平行排列。真皮淺層與深層的界限不明顯。

在耳廓橫切面的內(nèi)外側(cè)均可見(jiàn)皮脂腺。小鼠皮脂腺為分支泡狀腺,被結(jié)締組織分為兩個(gè)腺葉,幾乎無(wú)腺腔。分泌部充滿多角形細(xì)胞,胞核濃染,靠近導(dǎo)管部的細(xì)胞胞核大多已消失。在分泌部基膜附近可見(jiàn)體積較小的扁平狀細(xì)胞。導(dǎo)管部直接開(kāi)口于毛囊的頸部(圖4)。耳廓外側(cè)的皮脂腺數(shù)量明顯比內(nèi)側(cè)的多。

2.3 皮下組織

皮下組織位于真皮的深面,由較薄的疏松結(jié)締組織構(gòu)成。在耳廓橫切面的中央部位稍厚(圖3)。

2.4 軟骨層

軟骨層與皮下組織相連,呈連續(xù)的片狀分布。在靠近耳廓外側(cè)的軟骨膜與大量的縱肌束相連,而在另一側(cè)未見(jiàn)有肌組織分布。軟骨層內(nèi)未見(jiàn)血管分布。軟骨層內(nèi)彈性纖維數(shù)量很少(圖5)。軟骨細(xì)胞由較粗的彈性纖維構(gòu)成的軟骨膜包裹。軟骨層內(nèi)細(xì)胞呈現(xiàn)單層或雙層分布,有些地方軟骨細(xì)胞相互擠壓呈現(xiàn)多角形。成熟的軟骨細(xì)胞較大,呈圓形或橢圓形,胞質(zhì)出現(xiàn)空泡,胞核受擠壓位于細(xì)胞外圍。在靠近軟骨膜的位置可見(jiàn)少量的幼稚軟骨細(xì)胞,細(xì)胞較小,呈橢圓形。另外少見(jiàn)有成對(duì)聚集的軟骨細(xì)胞,這些細(xì)胞的大小介于成熟和幼稚軟骨細(xì)胞之間(圖6)。

3 討論

3.1 軟骨組織

軟骨為僅次于骨而支持動(dòng)物機(jī)體承受壓力的堅(jiān)硬組織。根據(jù)所含纖維性質(zhì)和數(shù)量不同,軟骨組織分為彈性軟骨、透明軟骨和纖維軟骨等三種類(lèi)型。彈性軟骨主要分布于機(jī)體的耳廓,會(huì)厭、咽鼓管和喉等處,具有支持、彈性等特殊的生理功能,其組織發(fā)生來(lái)源于中胚層的間充質(zhì),與透明軟骨和纖維軟骨的發(fā)生略有不同。

目前對(duì)彈性軟骨的組織學(xué)和組織發(fā)生報(bào)道較少,對(duì)透明軟骨的組織學(xué)和組織發(fā)生研究甚多,因?yàn)榕咛テ陂g透明軟骨構(gòu)成大部分四肢骨和中軸骨,以后逐漸被骨代替[1]。對(duì)透明軟骨的組織觀察為研究軟骨類(lèi)和骨的病變以及與血管供應(yīng)間的關(guān)系提供形態(tài)學(xué)資料。但是對(duì)于彈性軟骨的研究會(huì)有利于人們對(duì)關(guān)于三種類(lèi)型的軟骨在組織發(fā)生存在的不同和各自的組織發(fā)生特點(diǎn)的問(wèn)題的解答[2]。

彈性軟骨的形成并不說(shuō)明耳廓具有彈性,15周前的胎兒耳廓全為貼顱壁,16周后具有彈性的比例數(shù)漸增多,至25周后全為有彈性。胎兒耳廓在17周～18周時(shí)彈性纖維開(kāi)始增多并在軟骨細(xì)胞間交叉,形成與軟骨長(zhǎng)軸垂直的彈性纖維束,28周在結(jié)締組織內(nèi)出現(xiàn)彈性纖維[3]。以上說(shuō)明耳廓的彈性主要由彈性軟骨和其他組織內(nèi)彈性纖維的成熟度和多少有關(guān)。本次試驗(yàn)選用耳廓發(fā)育正常且具有彈性的成年Balb/c小鼠(9周齡),其軟骨層由較粗的彈性纖維包裹,呈現(xiàn)單層或雙層分布。在一定程度上耳廓的彈性程度和耳廓的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)變化可作為評(píng)估動(dòng)物胎齡的重要特征之一,再結(jié)合耳廓的組織發(fā)生特點(diǎn)會(huì)具有更大的意義[4]。

本試驗(yàn)中在Balb/c小鼠耳廓軟骨層內(nèi)未發(fā)現(xiàn)血管,但軟骨層外分布有血管。軟骨細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)系來(lái)自軟骨膜的血管滲透。這樣的結(jié)構(gòu)使得軟骨細(xì)胞代謝相對(duì)緩慢,不易修復(fù)。而在人殘耳軟骨層內(nèi)偶見(jiàn)有血管,且與血管相連的軟骨細(xì)胞周?chē)鸁o(wú)嗜堿性的軟骨基質(zhì)[5],對(duì)于殘耳軟骨的生物化學(xué)研究表明其與正常耳軟骨并無(wú)明顯差異[6]。形成這種現(xiàn)象的機(jī)制目前還需要進(jìn)一步研究。

小鼠耳廓軟骨是彈性軟骨且薄,這樣便具有較好的支持作用和塑型性。已有的研究表明僅耳廓軟骨細(xì)胞能用于構(gòu)建組織工程化喉管軟骨[7]。所以Balb/c小鼠耳廓軟骨也會(huì)具有一定的應(yīng)用前景[8-9]。綜合所報(bào)道的各種動(dòng)物試驗(yàn),耳軟骨在軟骨膜下切除后再生,需要有一定的條件。條件不同,軟骨再生的程度也不相同。最為重要的條件是軟骨膜必須完整。組織學(xué)上,軟骨膜可分為兩層,外層為排列緊密的膠原性結(jié)締組織,細(xì)胞與血管均較少,內(nèi)層為纖維稀疏但細(xì)胞與血管豐富的組織,軟骨層內(nèi)含有黏多糖等物質(zhì),但無(wú)神經(jīng)和血管,因此要獲得軟骨再生必須把軟骨膜保護(hù)好。軟骨再生的另一重要條件是移植床應(yīng)有良好的血運(yùn)[10-11]。

近來(lái)一些研究也表明M RL/MpJ小鼠的耳廓具有受傷后再生而不形成瘢痕的特性[12],Balb/c小鼠是否具有這種特性還有待于進(jìn)一步研究。

3.2 皮脂腺

在機(jī)體內(nèi)根據(jù)腺體的生理功能和結(jié)構(gòu)不同,可分為內(nèi)分泌腺和外分泌腺[13]。皮脂腺為外分泌腺,光鏡下觀察小鼠的皮脂腺是分支泡狀腺,被結(jié)締組織分為兩個(gè)腺葉且無(wú)腺腔。明顯可見(jiàn)體積相對(duì)較大的分泌部和體積相對(duì)較小的導(dǎo)管,導(dǎo)管一般比較短,上皮為復(fù)層扁平上皮?？拷鼘?dǎo)管處腺細(xì)胞胞核多已消失,細(xì)胞輪廓已不明顯。分泌部基膜周緣發(fā)現(xiàn)有體積小的未分化的扁平細(xì)胞。這些觀察結(jié)果與皮脂腺特殊分泌方式密切相關(guān)。與家畜相比,小鼠皮脂腺并不具有特別的結(jié)構(gòu),只是腺葉數(shù)量較少[14]。皮脂腺細(xì)胞分泌方式為全漿分泌,即腺細(xì)胞在分泌過(guò)程中不斷向?qū)Ч芤苿?dòng),最后崩潰,混同脂類(lèi)分泌物一起排出。靠近基膜周緣處的體積小的扁平細(xì)胞具有增殖能力,不斷產(chǎn)生新的腺細(xì)胞以補(bǔ)充因分泌喪失的腺細(xì)胞。最近,日本學(xué)者Nagai等發(fā)現(xiàn)鼠的皮脂腺細(xì)胞以微泡形式分泌皮脂,微泡直徑0.5 nm～5 nm,由許多脂質(zhì)微粒體組成[15]。

皮脂腺最主要的作用是構(gòu)成一道機(jī)體與外界隔離的終末屏障。另外,分泌的皮脂還能抑制某些病原微生物生長(zhǎng)[16]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)耳廓外側(cè)的皮脂腺數(shù)量明顯較內(nèi)側(cè)數(shù)量多。這是因?yàn)槎鈧?cè)與內(nèi)側(cè)相比和外界接觸較多,皮膚更易干燥,與不利因素的接觸機(jī)會(huì)更大,需要機(jī)體自身的保護(hù)和防御更多。這樣決定了在耳廓外側(cè)部位會(huì)分布有更多的皮脂腺。這種適應(yīng)環(huán)境的方式在自然界是非常普遍的現(xiàn)象。

[1]王立平,黨耕町.未分化間充質(zhì)細(xì)胞成骨作用的研究進(jìn)展[J].中華外科雜志,1998,36(2):83.

[2]宋秀軍,陳代雄,方 寧,等.人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞具有分化成軟骨及成骨細(xì)胞的潛能[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2007,50(11):10056-10060.

[3]高佩安,魏成芳,李亞魯,等.胎兒耳廓彈性軟骨及其組織的發(fā)生[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1995,16(3):185.

[4]B radam an te Z,Svajger A.Pre-elastic(oxytalan)fib res in the developing elastic cartilage of the external ear of the rat[J].J Anat,1977,123(3):735-743.

[5]劉 峰,周曉艷,張作峰.耳廓再造的應(yīng)用解剖學(xué)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2008,16(7):936-939.

[6]金 驥,莊洪興.小耳畸形殘耳軟骨的生物化學(xué)研究[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志,2004,10(1):21-23.

[7]Henderson J H,Jean F,Mansoru W M.Cartilage tissue engineering for laryngotracheal reconstruction:Com parison of chondrocytes from th ree anatom ic locations in the rabbit[J].Tissue Eng,2007,13(4):843-853.

[8]Han E H,Bae W C,Nancy D,et al.Shaped,stratified,scaffold-free grafts for articular cartilage defects[J].C lin Orthop Relat,2008,466(8):1912-1920.

[9]張 路.構(gòu)建組織工程化耳廓軟骨修復(fù)體[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2008,17(10):1552-1554.

[10]王躍建,王天鐸.長(zhǎng)段氣管缺損重建[J].國(guó)際耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,31(5):275-277.

[11]陳長(zhǎng)永,范 飛.耳廓軟骨在鼻整形與鼻再造術(shù)中的臨床應(yīng)用[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2008,17(9):1401-1403.

[12]M etcalfe A D,W illis H,Beare A,et al.Characterizing regeneration in themammalian ex ternalear[J].JAnat,2006,209(4):439-446.

[13]吳巧云,鄭 敏.皮脂腺功能及調(diào)控的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2006,20(12):1217.

[14]李寶仁.家畜組織學(xué)與胚胎學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1979:169-174.

[15]Nagai A,Sato T,Akim oto N,et al.Isolation and identification of histone H-protein enriched in microvesicles secreted from cultured sebocytes[J].Endocrinology,2005,146(6):2593-2601.

[16]MeyerW,Bollhorn M,Stede M.Aspects of general antim icrobial properties of skin secretions in the coin/non seal Phoca vitu lina[J].Dis Aquat Organ,2000,41(1):77-79.