崔麗瑾,王興龍,2*,任林柱,李曉艷,郎需龍,張付賢,王英超

(1.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春 130062;2.吉林大學人獸共患病研究所,吉林長春 130062;3.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春 130062)

口蹄疫病毒(Foot-and-m outh disease virus,FMDV)是小RNA病毒科的典型代表,引起偶蹄動物的急性接觸性傳染病。由于其血清型眾多,變異頻繁,各血清型之間沒有交叉保護,給該病的防控造成很大困難。2009年1至4月份,我國南方的多個省份相繼發(fā)生A型、亞洲1型口蹄疫疫情,對口蹄疫防控策略的研究更加緊迫。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是小的短雙鏈 RNA,即小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)介導的對靶基因轉錄后水平的抑制作用,該作用具有高度特異性,已被廣泛作為腫瘤治療和抑制病毒感染的特異性手段,并取得了良好的進展。

FMDV基因組為單股正鏈 RNA,全長約8.5 kb,可直接作為信使RNA,是RNAi作用的適合對象。FMDV具有小RNA病毒的共同特征,其RNA的5′末端沒有帽子結構[1],蛋白翻譯起始于5′非翻譯區(qū)中的內部順式調控元件,即內部核糖體進入位點(IRES)。目前已證實IRES是FMDV基因組中存在的惟一一個蛋白翻譯順式調控元件,它以某種特殊的機制關閉宿主細胞的蛋白合成來合成病毒自己所需的蛋白質,完成病毒的復制和裝配,并導致機體的一系列病理損害。鑒于 IRES在FMDV復制過程中所起的關鍵作用,本研究對其序列的保守性和二級結構進行了分析,篩選了2個RNA干擾靶位,并構建了shRNA真核表達載體,為進一步研究針對IRES區(qū)域的RNA干擾效果、構建口蹄疫病毒RNAi技術體系提供一定的理論依據(jù)和試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

FMDV WFL株cDNA序列(GenBank登錄號:EF175732,由軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所第五研究室獲得),大腸埃希菌(E.coli)DH 5α、載體pSilerncer 1.0-U6(Am bion公司)由軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所動物性食品安全研究室第五研究室保存。T4 DNA ligase為Promega公司產品,限制性內切酶、DNA M arker、DNA 凝膠回收純化試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產品,LB培養(yǎng)基為OXOID公司產品。

1.2 方法

1.2.1 FMDV IRES序列保守性分析 隨機選取了GenBank上發(fā)表的7個血清型的FMDV IRES區(qū)段的cDNA序列28條,與試驗用WFL株的相應區(qū)段用DNA Star進行同源性比對,考察序列的保守性,并尋找最保守的區(qū)域。

1.2.2 FMDV IRES序列二級結構及功能區(qū)分析利用網(wǎng)上RNA secondary structure prediction工具對 WFL株 IRES序列進行二級結構預測(http://www.genebee.msu.su/services/rna2-re-duced.htmL),并結合國內外對IRES二級結構及功能區(qū)域的研究結果,共同作為siRNA靶序列選擇的參考依據(jù)。

1.2.3 siRNA靶序列的選擇 將試驗用FMDV WFL株IRES的 cDNA序列提交Ambion公司的網(wǎng)上siRNA在線設計軟件(http://www.abmion.com/tech lib/m isc/siRNA finder.htmL),在給出的候選干擾靶序列中選擇GC%在30%～60%之間、并經網(wǎng)上Blast檢驗,保留與宿主基因無明顯同源性的序列,參考1.2.1和1.2.2的分析結果,作為理論篩選確定的siRNA靶序列。

1.2.4 shRNAs表達質粒的構建 根據(jù)U 6載體要求,將選擇的siRNA序列設計成shRNA表達模板的DNA插入序列,由上海生工生物工程技術服務有限公司分別合成61 nt的shRNA編碼鏈和53 nt的互補鏈DNA,退火后連接U6載體大片段。將連接產物轉化DH 5α感受態(tài)細菌,涂布于含Amp+的LB瓊脂平板,挑取單個菌落擴大培養(yǎng),小量提取質粒[2]進行酶切鑒定并交上海鼎安生物科技公司測序。

2 結果

2.1 FMDV IRES序列的保守性分析

本試驗所使用的FMDV WFL株為O型,其全長為8 155 nt,其中,IRES序列在WFL株全基因組中的位置為 602 nt～1 039 nt,長度為 458 nt。經DNA Star比對,與GenBank上發(fā)布的7個血清型FMDV基因組的相應序列的同源性在73.5%～100%之間,特別是除南非(SAT)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ之外的O、A、C和A sia 1型之間的同源性高于86.4%,說明FMDV的IRES區(qū)段保守性較好,適合作為RNA i的靶區(qū)段。

2.2 FMDV WFL株IRES序列二級結構預測及功能區(qū)分析結果

利用網(wǎng)上在線 RNA secondary structure prediction工具對WFL株IRES序列進行了二級結構預測,結果見圖1。從圖1中可以看出,IRES序列在不同部位形成了莖(stem region)和環(huán)結構,siRNA序列的選擇應盡量避開復雜的二級結構,選擇容易結合的環(huán)(loop region)部。Pilipenko E V等[3]對3株腦心肌炎病毒、3株FMDV和3株Theiler鼠腦心肌炎病毒的IRES二級結構分析表明,上述毒株的IRES均具有相同的5個結構域的折疊。而且上述毒株的IRES二級結構擁有部分相同的單鏈序列。張顯升等[4]的研究表明,通過 IRES二級結構分析,第72、164、207、208、377和406位點均位于所有毒株IRES二級結構的環(huán)中。而 IRES的第373～405位非常保守,序列為TTCTT(A)TAAAAGC(T)GC(T)CCC(T)AGTTTAAAAAGCTTCTA,此區(qū)域的A/T含量高達73%,而且在這個區(qū)域的兩翼富含G/C。因此,推斷這個區(qū)域可能是FMDV的復制原點(病毒編碼的依賴RNA的RNA聚名酶結合位點),或是與翻譯起始或某些蛋白因子的識別或結合有關的位點[5]。

圖1 IRES序列的二級結構預測效果圖Fig.1 The secondary structure prediction of IRES sequence

2.3 靶序列的選擇結果

參照Am bion公司的 siRNA在線設計軟件給出WFL株的IRES序列的siRNA干擾靶序列結果,經Blast檢驗,去除與宿主存在同源的序列,結合序列保守性分析、基因序列功能區(qū)分析,確定了分別針對265 nt～283 nt和395 nt～413 nt的2個siRNA干擾靶序列,分別處于在圖1上標注的 A(IRES-12)和B(IRES-20)位置,其核酸序列見表1,其中IRES-20位于多分支環(huán)(m ultibranched loop)中,屬于siRNA最易結合部位;IRES-12位于發(fā)夾環(huán)(hairpin loop)中,屬于比較易結合部位。其保守性分析結果如圖2所示,可見 IRES-12、IRES-20在7個血清型間都表現(xiàn)出很高的同源性。

表1 siRNA的靶序列Table1 Target sequences of siRNA

2.4 pSilencer 1.0-U6-shRNA表達質粒的構建及鑒定

合成的單鏈DNA插入序列為由9 nt的非互補堿基(即小發(fā)夾結構的“環(huán)”)分割的反向互補序列,以保證在U 6啟動子指導下轉錄成單鏈時,能按堿基互補原則形成小發(fā)夾結構的RNA分子(shRNA)(表2)?；パa的DNA模板退火后分別形成ApaⅠ和Eco RⅠ酶切位點的黏性末端,與同樣經 ApaⅠ和Eco RⅠ雙酶切線性化的pSilencer1.0-U 6載體片段連接,小提重組質粒以 Hin dⅢ酶切進行初步鑒定,證明外源片段已連入載體(圖3),之后,經測序和序列分析,表明 shRNA表達片段插入正確,U6啟動子序列無突變發(fā)生,圖4為測序峰圖,序列下劃線部分為插入序列的莖環(huán)部。

圖2 siRNA靶序列同源性分析結果Fig.2 H om ology analysis for target sequences of siRNA

表2 針對載體pSilencer1.0-U6表達shRNA的DNA插入序列Table2 DNA insert sequences exp ressing shRNAs for the vector pSilencer1.0-U 6

圖3 重組質粒酶切鑒定結果Fig.3 Identification of recombinant plasm ids by endonu clease digestion

圖4 重組質粒插入序列部分的測序峰圖Fig.4 Sequencing diagram of the insert sequence of recombinan t plasm id

3 討論

RNA干擾對靶RNA的降解,不僅能夠抑制病毒蛋白成分的產生,同時能夠直接減少病毒的數(shù)量,并抑制其在細胞內的復制,達到最終清除病毒的目的,因此其對病毒性疾病的防控具有重要的臨床應用價值。國內外一些學者已經開展了關于FMDV的RNA i的研究,但因所選擇的siRNA的序列不同,所報道的對 FMDV的抑制效果差異很大。Ronen K等[6]報道針對FMDV 3B和3D基因設計的siRNA對FMDV的抑制效率可達100%。Chen W Z等[7]研究了siRNA對FMD表面抗原蛋白VP1基因的抑制作用,結果表明,在BHK-21細胞中siRNA表達質?？墒笷MDV VP1基因的表達降低80%～90%。de Los Santos T等[8]證明針對FMDV基因非編碼區(qū)設計的shRNA可有效地抑制多種血清型的FMDV復制。

由于FMDV像其他的RNA病毒一樣,具有很高的遺傳多態(tài)性,迄今為止,血清學分析發(fā)現(xiàn)了多達7種的血清型和超過60種的亞型,而且,每個亞型都有許多基因組變異的毒株[9]。因此,針對病毒基因組的保守區(qū)域設計siRNA是利用RNA干擾技術抑制病毒增殖的關鍵。其干擾靶序列的保守性越高,作用于各種血清型的干擾潛力就越大。

IRES是小RNA病毒翻譯起始的調控元件,在FMDV復制過程中起著非常重要的作用。張顯升等[4]對China/99等包括 O、A、Asia I等血清型的8條FMDV IRES序列進行了比對,發(fā)現(xiàn)China/99株與 O1 K 、O1 Campos、A sia 1 、A 24、A 12、TWCP/97和TW TY/97等7個毒株的IRES核苷酸序列無明顯的差異,表明該段序列較為保守。從本研究給出的序列比對直觀結果(圖2)可以看出,所選siRNA干擾靶位點序列大部分在流行較為廣泛的O、A、C、Asia 1型之間保守性比較高,也有部分序列在7個血清型都呈現(xiàn)較好的保守性,說明所選擇的siRNA序列有很好的干擾FMDV復制的潛力。雖然有悖于干擾設計時選用編碼這為靶位的一般原則,但該區(qū)域的高度保守性及重要功能決定了它可以作為干擾的理想靶位。

研究還表明,在m RNA中局部形成的二級結構會影響siRNA的靶位點可及性[10],因此,正確地預測m RNA二級結構的能力,可能是獲得高效siRNA的一個重要因素。Hellen C V等[11]根據(jù)對一級結構的序列、結構和二級結構的系統(tǒng)變異分析,報道過小RNA病毒科的IRES至少有兩種類型的二級結構圖形。他提到,由于都是以專業(yè)軟件進行的二級結構預測,因此還無法斷定何種二級結構最為正確,但二級結構的預測卻能為今后的研究提供必不可少的依據(jù)。本研究利用網(wǎng)上專業(yè)工具對IRES的RNA二級結構進行預測,以便考察備選的siRNA序列在基因序列二級結構中的大致位置,為干擾位點的選擇提供了一種參考依據(jù)。

目前,RNAi技術的應用研究發(fā)展迅速,然而并非所有指向靶基因的siRNA在導入細胞后都能夠產生RNAi,其中siRNA序列的設計、篩選和導入都非常關鍵。siRNA的有效性高度依賴其特定靶位點的確定,而關于siRNA序列的選擇,目前尚無完全統(tǒng)一的準則,幾大研究機構的網(wǎng)站及公司的設計軟件設計的siRNA的序列也有不統(tǒng)一之處。本研究通過對IRES序列的全面分析,選擇了針對FMDV復制的重要功能區(qū),且高度保守、易于結合的2個干擾靶位,構建了shRNA表達質粒,利用這種具有反折結構的DNA模板可以在哺乳動物細胞中轉錄成眾多的shRNA,啟動RNAi的效應,避開了RNA操作的困難,為應用RNA i技術防控和抑制FMDV感染進行了有益探索。

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