史 赫,張瑞巖,張林波,馬翠平,張西臣,劉 全*,吳永魁*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學院,吉林長春 130118;2.解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春 130062;3.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春 130062)

硝唑尼特(nitazoxanide,NTZ)化學名稱2-乙酰氧基-N-(5-硝基-2-噻唑),是一種硝噻柳酸酰胺的衍生物,由Romark實驗室于1976年首次報道作為一種新型抗寄生蟲藥物[1]。它具有廣譜、耐受性好、安全劑量高、毒副作用低等優(yōu)點,而且還具有抗細菌、抗病毒活性[2]。杜氏利什曼原蟲 (Leishmania donovani)寄生于人體的肝、脾、骨髓和淋巴結(jié)等細胞內(nèi),蟲體圓形或卵圓形,它能引起黑熱病,又名黑熱病原蟲[3]。傳統(tǒng)的治療藥物包括五價銻類復合物、兩性霉素B、噴他脒等,但是隨著五價銻類藥物的耐藥現(xiàn)象日趨增強,治療效果不斷下降,兩性霉素B影響腎功能也會產(chǎn)生大量的副作用,而噴他脒會導致糖代謝紊亂等[4]。應用不同濃度的硝唑尼特對體外培養(yǎng)的杜氏利什曼原蟲前鞭毛體進行試驗,以考察硝唑尼特對杜氏利什曼原蟲的抑殺效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 杜氏利什曼原蟲 杜氏利什曼原蟲采自四川省(編號 sc10)。

1.1.2 藥物 硝唑尼特為黃色粉末,由青島康地恩藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號20080420)。

1.2 方法

將體外培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的利氏曼原蟲離心回收,用白細胞血球計數(shù)板對蟲體計數(shù),用M 199培養(yǎng)液稀釋至5×106個/mL后接種到96孔板中,每個孔190μL,試驗共分8組,每組12個孔。分別將6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 和200 μg/mL 的硝唑尼特接種到含有利氏曼原蟲的96孔板中,每孔10μL,溶劑對照組加入等量的DMSO溶劑,陽性對照組加入3μg/mL的兩性霉素B 10μL,空白對照組不做任何處理。分別于培養(yǎng)48 h和72 h時在顯微鏡下觀察蟲體運動及形態(tài)變化,試驗重復3次。

1.2.1 原蟲培養(yǎng) 蟲體前鞭毛體在NNN培養(yǎng)基中傳代保種,擴大培養(yǎng)時轉(zhuǎn)入含100 mL/L小牛血清的M 199培養(yǎng)基中培養(yǎng),孵育溫度為28℃。

1.2.2 試驗分組 試驗設(shè) 6.25、12.5、25 、50、100μg/mL和200μg/mL 6個濃度組;溶劑為DMSO(與培養(yǎng)基的體積比為0.1%);陽性對照物兩性霉素B為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品,用時配成3μg/mL的水溶液。

1.2.3 結(jié)果判定 肉眼觀察培養(yǎng)基顏色變化和蟲體鞭毛活動度;光鏡下觀察鞭毛體的形態(tài),并以白細胞計數(shù)板計數(shù)計算增殖抑制率;姬姆薩染色觀察鞭毛體大小和形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基顏色及蟲體變化

蟲體培養(yǎng) 48 h和 72 h后,試驗組(50、100、200μg/mL)培養(yǎng)基顏色仍為紅色,試驗組(6.25、12.5、25)培養(yǎng)基顏色變?yōu)榈t色,溶劑對照和空白對照組顏色變?yōu)榈t色至黃色。鏡下觀察,試驗組蟲體鞭毛活動較弱或幾乎不動,蟲體大部分不完整,而空白對照組和DMSO對照組蟲體呈長梭形,運動活躍,顯示不同濃度硝唑尼特對蟲體呈現(xiàn)明顯抑制作用。

2.2 計數(shù)

隨著硝唑尼特濃度的升高和培養(yǎng)時間的增長,杜氏利什曼原蟲數(shù)量下降(圖1)。培養(yǎng)48 h時,試驗組 6 個濃度(6.25 、12.5 、25、50、100、200 μg/mL)對蟲體的抑制率分別為28.1%、43.8%、53.1%、68.8%、87.2%和96.9%,72 h時,試驗組6個濃度對蟲體的抑制率分別為31.2%、45.9%、57.1%、73.6%、90.5%和100%,DMSO對照組對蟲體的抑制較弱,48 h和72 h分別為1.28%和1.36%,兩性霉素B對蟲體抑制率為100%。

圖1 不同濃度硝唑尼特對利什曼原蟲的抑制作用Fig.1 The inhibition effect of differen t concentrations of nitazoxanide on Leishmania donovani

2.3 染色觀察

姬姆薩染色后,可見試驗組蟲體變形,核、動基體不完整,細胞質(zhì)內(nèi)有空泡,鞭毛脫落,空白對照組和DMSO對照組培養(yǎng)基變黃,蟲體運動活躍,大部分呈長梭形核、動基體、胞膜及鞭毛清晰、完整(圖2)。

3 討論

杜氏利什曼原蟲是一種專營寄生生活的單細胞低等真核生物,其生活史包括寄生于媒介昆蟲白蛉消化道內(nèi)的前鞭毛體期和寄生于脊椎動物單核巨噬細胞內(nèi)的無鞭毛體期,能引起嚴重危害人類健康的內(nèi)臟利什曼病[5],該病分布80多個國家,世界衛(wèi)生組織報道目前患者數(shù)超過1 500萬,每年新發(fā)病例為50多萬[6]。傳統(tǒng)用藥都有一定的局限性。硝唑尼特是美國藥品和食品監(jiān)督管理局批準的第1個用于治療隱孢子蟲屬的藥物,是四十年來發(fā)現(xiàn)的第一個治療賈第蟲屬的新藥[7],該藥給藥方式為口服干懸劑,服用方便,體內(nèi)最大安全劑量可達5 g/kg[8]。但是,至今未見將該藥用于利什曼原蟲的報道。

圖2 藥物對蟲體形態(tài)的影響(1 000×)Fig.2 Effects of the nitazoxanide on parasite morphology(1000×)

體外培養(yǎng)的杜氏利什曼原蟲經(jīng)不同濃度的硝唑尼特作用后培養(yǎng)基顏色未變,說明試驗組蟲體減少。藥物先使蟲體變形,活動度下降,隨藥物濃度的增加、作用時間增長,蟲體活動度逐漸下降直至死亡。姬姆薩染色發(fā)現(xiàn)蟲體的核、動基體不完整以至消失,最終蟲體變成碎片,表明硝唑尼特對離體杜氏利什曼原蟲有較強的體外抑制作用。

硝唑尼特作用機制之一是抑制丙酮酸鹽:鐵氧還蛋白氧化還原酶(PFOR)參與的酶依賴性電子轉(zhuǎn)移作用,此作用對于厭氧能量代謝來說是必不可少的[9]。硝唑尼特對杜氏利什曼原蟲的抑殺作用是否與該機制有關(guān)尚需進一步研究。

[1]張可煜,王國友,薛飛群.抗寄生蟲新藥硝唑尼特研究進展[J].獸醫(yī)導刊,2007(12):30-31.

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