岳 鋒,寧紅梅,銀 梅,葛亞明,朱彥彩,周娟娟,賈文科,王文強(qiáng),黃小東,王選年,4*

(1.河南科技學(xué)院,動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003;2.雙匯集團(tuán)養(yǎng)殖部飼料廠,河南漯河462000;3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽471003;4.新鄉(xiāng)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(In fectious bursal disease virus,IBDV)引起雞的一種高度接觸性、免疫抑制性傳染病。主要感染3月齡以內(nèi)的青年雞,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。IBDV基因組為雙股RNA(dsRNA),由A和B兩個(gè)片段組成,其中A片段包含兩個(gè)部分重疊的開放閱讀框(ORFs),小ORF編碼17 ku的非結(jié)構(gòu)蛋白VP5,大ORF編碼110 ku的多聚蛋白NH 2-pVP2-VP4-VP3-COOH;而B片段編碼VP1蛋白,具有RNA依賴于RNA聚合酶活性[3-7]。在IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白中,VP2和VP3是組成病毒核衣殼的主要蛋白成分,約占病毒蛋白成分的51%,VP2是宿主主要的保護(hù)性中和抗原,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,其兩個(gè)親水區(qū)氨基酸212位～224位和氨基酸314位～324位是構(gòu)成構(gòu)象表位的重要組分,兩個(gè)親水區(qū)的氨基酸變化是毒株變異的主要因素[8-11]。

2008年河南新鄉(xiāng)地區(qū)某養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)生雞傳染性法氏囊病。主要臨床癥狀表現(xiàn)為,發(fā)病初期雞只精神沉郁、羽毛蓬松、啄肛,隨著病情的發(fā)展,采食量逐漸下降,拉黃白色或綠色糞便,最后因脫水或衰竭而死,發(fā)病率在10%～35%之間,病死率為5%左右。病理剖檢,雞的腺胃和肌胃的交界處有出血點(diǎn),大腿和胸部肌肉有刷狀出血斑,法氏囊腫大,外包裹透明樣膠凍狀滲出物,黏膜皺褶上有出血點(diǎn)或出血斑,內(nèi)有黃白色分泌物,腎臟有輕度的腫大和尿酸鹽沉積,呈花斑樣腎,盲腸扁桃體腫大出血。初步判定該雞場(chǎng)發(fā)生雞傳染性法氏囊病。采取發(fā)病雞的法氏囊,經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒分離鑒定獲得IBDV。本研究擬通過病毒基因的克隆與分析,進(jìn)一步鑒定該病毒的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 IBDV XX08毒株,由河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 試劑 PCR試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;AM V為Promega公司產(chǎn)品;Trizol為美國invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參考Gen Bank中已發(fā)表的IBDV AY319768基因序列,用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,預(yù)計(jì)擴(kuò)增IBDV VP2高變區(qū)593 bp的片段。引物序列為:

1.2.2 病毒總RNA的提取 用Trizol法[12]提取病毒總RNA。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 取制備的RNA11.5μL(100℃5m in預(yù)變性),Oligo(dT)1μL,dNTP 2.5μL混合,70℃作用5m in,然后于冰上加入5×buffer 5μL,RNA抑制劑5μL,AMV 1μL,DEPC水3μL,于42℃作用60min,合成cDNA第一條鏈。

1.2.4 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系:cDNA 2μL,10×bu ffer 2.5μL,M gCl2 21.5μL,dNTP 2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,Tag酶0.1μL,DDW 14.9μL。反應(yīng)參數(shù):94℃5 m in,然后進(jìn)入40個(gè)循環(huán):94℃1min,54℃1 min,72℃1 min;循環(huán)完畢后72℃繼續(xù)延伸10min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序 PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.6 推導(dǎo)氨基酸序列分析 用DNA Star軟件將測(cè)得的核苷酸序列轉(zhuǎn)換成氨基酸序列,并進(jìn)行氨基酸的同源性及遺傳進(jìn)化樹的分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR產(chǎn)物

將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果出現(xiàn)593 bp的目的條帶(圖1)。然后進(jìn)行大量擴(kuò)增,鑒定正確后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果見圖2。

圖1 雞IBDV VP2高變區(qū)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 RT-PCR amplification product of chicken IBDV VP2 gene highly variable region

圖2 雞IBDV XX08毒株VP2高變區(qū)cDNA序列及推導(dǎo)氨基酸序列Fig.2 The sequences of cDNA and deduction amino acids of chicken IBDV XX08 strain VP2 high ly variable region

2.2 推導(dǎo)氨基酸序列及遺傳進(jìn)化樹分析

擴(kuò)增核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列見圖2,氨基酸序列與GenBank中雞IBDV經(jīng)典弱毒株D78(AF49992911)、歐洲超強(qiáng)毒株UK 661(CAA 63416)[13]、日本超強(qiáng)毒株OKYM(BAA 08555)[14]和經(jīng)典毒株Cu-1(X 16107)比較見圖3,XX 08毒株與超強(qiáng)毒株序列具有較高同源性。氨基酸序列同源性分析見圖4,結(jié)果顯示該毒株與超強(qiáng)毒株OKYM、UK 661和經(jīng)典弱毒株D78的同源性均為96.8%,與經(jīng)典毒株Cu-1的同源性為95.8%。各毒株的遺傳進(jìn)化樹見圖5,由圖5可見XX08毒株與超強(qiáng)毒株OKYM和UK 661位于同一進(jìn)化樹。

圖4 雞IBDV XX08毒株氨基酸同源性分析Fig.4 Homology analysis of amino acids in chicken IBDVXX 08 strain

圖5 雞IBDV XX08毒株遺傳進(jìn)化樹分析Fig.5 Phy logenetic analysis of chicken IBDV XX 08 strain

3 討論

應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從分離毒株中擴(kuò)增出593 bp(676-1269)VP2高變區(qū),經(jīng)測(cè)序、推導(dǎo)出的氨基酸序列與超強(qiáng)毒株和經(jīng)典弱毒株進(jìn)行比對(duì)分析和進(jìn)化分析,XX08毒株VP2高變區(qū)與超強(qiáng)毒株和弱毒株的同源性均為96.8%,且與超強(qiáng)毒株位于同一進(jìn)化樹。

在IBDV VP2蛋白中222A、256I、294I和299S是vvIBDV的4個(gè)特征性氨基酸,此4個(gè)氨基酸使病毒局部的親水性增強(qiáng),導(dǎo)致毒力增加,222位的A被P代替可使IBDV毒力減弱;274N和284T是弱毒株的兩個(gè)特征性氨基酸[15],并且此兩個(gè)氨基酸的變化與IBDV的適應(yīng)性有關(guān)。

雞IBDV VP2是病毒的主要保護(hù)性抗原蛋白,刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體。VP2高變區(qū)(206Y-350T)是決定病毒毒力和抗原性的關(guān)鍵區(qū)域,包含2個(gè)親水區(qū)(AA 212D-224G,AA 314T-324Q)和1個(gè)七肽區(qū)S-W-S-A-S-G-S(AA 326S-332S),2個(gè)親水區(qū)參與病毒中和性抗原表位的形成,且不同毒株之間具有抗體交叉反應(yīng),說明兩個(gè)親水區(qū)的氨基酸序列比較保守。七肽區(qū)與病毒的毒力有關(guān),其上的4個(gè)絲氨酸殘基暴露在VP2蛋白外部,能與細(xì)胞膜形成分子間氫鍵,可能參與了病毒的黏附和成熟過程。本研究對(duì)XX 08毒株VP2高變區(qū)特征性氨基酸的分析顯示,影響毒力的2個(gè)氨基酸279D和284A與超強(qiáng)毒株一致,在第一個(gè)親水區(qū)222位的A被P替代,導(dǎo)致病毒的毒力減弱,vv IBDV的4個(gè)特征性氨基酸中,只有294I與其一致,而222P、256V和299N與經(jīng)典弱毒株一致,9個(gè)特征性氨基酸212D、222P、256V、279D、284A、294I、299N、318G和322G中,除了222P、256V和299N與經(jīng)典弱毒株一致外,其余的都與超強(qiáng)毒株一致。

通過以上對(duì)XX08毒株的氨基酸同源性和特征性氨基酸的分析,并結(jié)合臨床癥狀,推測(cè)XX08毒株可能為中等強(qiáng)毒力毒株,為XX 08毒株的生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

[1] 袁維峰,吳保明,張?chǎng)斡?等.三株雞傳染性法氏囊病毒弱毒株的分離與分子鑒定[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2009,17(1):29-32.

[2] Gao Y,Liu W,Gao H,et al.Effective inhibition of infectious bursal desease virus replication in vitro by DNA vector-based RNA interference[J].An tiviral Res,2008,79(2):89-94.

[3] 高玉龍,高宏雷,鄧小蕓,等.雞傳染性法氏囊病毒VP2基因的原核表達(dá)與抗原性分析[J].中國生物制品學(xué)雜志,2006,19(2):143-145.

[4] 朱桂銀,王旭東,朱建波.傳染性法氏囊病毒基因組、蛋白和分子致病機(jī)理研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,22(3):448-451.

[5] Wei Y,Yu X,Zheng J,et al.Reassortant infectious bursal disease virus isolated in China[J].Virus Res,2008,131(2):279-282.

[6] 易道生,張 倩,李 楠,等.雞傳染性法氏囊病毒江蘇地方株的分離及其VP2基因分析[J].畜牧與獸醫(yī),2008,40(10):63-67.

[7] Deng X Y,Gao Y L,Gao H L,et al.Iden tification of VP3 antigenic epitopes of infectious bursal desease virus[J].Bing Du Xue Bao,2007,23(4):305-311.

[8] Brand t M,Yao K,Liu M,et al.Molecular determ inan ts of virulence,cell tropism,and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus[J].JVirol,2001,75:11974-11982.

[9] Wang X N,Zhang G P,Zhou JY,et al.Identification of neutralizing epitopes on the VP2 protein of infectious bursal disease virus by phage-displayed heptapeptide library screening and synthetic pep tide mapping[J].Viral Immunol,2005,18:549-557.

[10] Cao Y C,Yeung W S,Law M,et al.Molecular characterization of seven chinese isolates of in fectiousbursal disease virus:classical,very virulent and variant strains[J].Avi Dis,1998,42:340-351.

[11] Letzel T,Cou libaly F,Rey F A,et al.Molecular and structural bases for the antigenicity of VP2 of infectious bu rsal disease virus[J].JVirol,2007,81:12827-12835.

[12] Jackwood D J,Kibenge F SB,Mercado CC,et al.The use of biotin-labeled cDNA probes for the detection of infectiousbursal disease viruses[J].Avi Dis,1990,34:129-136.

[13] Brown M D,Skinner M A.Coding sequences of bothgenomeseg ments of a European very virulent infectious burs al disease virus[J].V irus Res,1996,40:1-15.

[14] Yam aguchi T,Iwat a K,Kobayashi M.Epitope mapping of capsid proteins VP2 and VP3 of IBDV[J].Arch Virol,1996,41:1493-1507.

[15] Loon A A W M,Haas N D,Zeyda I,et al.Alteration of amino acids in VP2 of very virulent infectious bursal disease virus results in tissue culture adaptation and attenuation in chickens[J].JGen Virol,2002,83:121-129.