馬紅霞,周運恒,范列英,安玉會

1)同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院檢驗科上海 200120 2)武警上海總隊醫(yī)院檢驗科上海 201103 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 鄭州 450001

△女,1975年11月生,碩士,主管技師,研究方向:老年癡呆的分子生物學(xué)及藥物治療,E-mail:mahx2004@126.com

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以老年斑、神經(jīng)細胞纖維纏結(jié)和神經(jīng)細胞丟失為主要病理改變[1],其病因及發(fā)病機制尚不清楚,目前尚缺乏有效的治療手段。神經(jīng)肽是具有神經(jīng)信息傳遞和調(diào)控作用的一類物質(zhì),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛,參與機體多種功能的調(diào)節(jié)。An等[2-3]從牛腦組織中首次分離出一種新的酸性牛神經(jīng)肽,并發(fā)現(xiàn)其可通過增加腦內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,提高腦內(nèi)抗氧化能力,減少腦內(nèi)一氧化氮(NO)的生成,改善腦內(nèi)能量代謝障礙,對血管性癡呆模型小鼠和 AD模型大鼠有良好的治療效果。作者觀察了酸性肽對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞生長增殖的影響,報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(Sigma公司),乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(北京中生北控公司),MTT(Sigma公司),二甲基亞砜、胰酶和多聚賴氨酸(Sigma公司),臺盼藍(鄭州陽光公司), DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司),胎牛血清(鄭州真科生物有限公司)。

1.2 大鼠星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)與鑒定[4-5]取出生后2 d內(nèi)的SD大鼠(鄭州大學(xué)實驗動物中心),無菌條件下斷頭取出大腦皮質(zhì)部分,投入PBS中,仔細剔除中腦、嗅球、海馬、腦膜及毛細血管等結(jié)構(gòu),進行星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)。取第 2代的星形膠質(zhì)細胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化細胞,接種于預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上,3 d后,先用 0.01 mol/L PBS漂洗,再用PBS配制的40 g/L多聚甲醛固定,經(jīng)含體積分數(shù)3%H2O2和體積分數(shù)10%甲醇的0.01mol/LPBS處理后,按照免疫細胞化學(xué)ABC染色方法進行GFAP抗血清(工作濃度為1:500)反應(yīng)。

1.3 實驗分組及樣品的制備 將純化培養(yǎng)的第 2代星形膠質(zhì)細胞用2.5 g/L的胰酶消化成單細胞懸液,以 5×105mL-1接種于 12孔培養(yǎng)板中,每孔 1 m L。實驗分 5組,每組設(shè) 7個復(fù)孔。無血清組(只加培養(yǎng)基不加血清)、胎牛血清對照組(加入含體積分數(shù) 20%的胎牛血清)、酸性肽低、中及高劑量組(分別加入37.5、75.0及150.0mg/L的酸性肽),分別培養(yǎng) 24、48及 72 h。實驗終止后,分別將上清液移入無菌的EP管中,1 000 r/m in離心5 min,再將上清液分別移入另一無菌EP管,-20℃冷藏待測。底層細胞用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后用PBS配制成相同體積的細胞懸液。

1.4 細胞存活率檢測 用玻棒蘸 1滴培養(yǎng) 24、48和 72 h的上述細胞懸液,每組 7個復(fù)孔,滴于血細胞計數(shù)板上,計算總細胞數(shù)。細胞用PBS輕洗2次,每孔滴PBS配制的4 g/L臺盼藍溶液200μL,混勻,滴于血細胞計數(shù)板上,3 min左右在倒置顯微鏡下觀察,計數(shù) 400個相鄰細胞中藍染細胞(死亡細胞)個數(shù)。細胞存活率=[(總細胞數(shù)-藍染細胞數(shù))/總細胞數(shù)]×100%。

1.5 細胞上清液LDH含量測定 采用日立7170全自動生化分析儀測定各組細胞上清液中 LDH的含量。

1.6 細胞增殖率的檢測 采用MTT法[6]。將純化培養(yǎng)的第2代星形膠質(zhì)細胞用 2.5 g/L的胰蛋白酶消化成單細胞懸液,以 5×105mL-1接種于 96孔板,按實驗設(shè)計處理細胞后,每孔加入20μL 5 g/L的MTT,然后再放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸去培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL,振蕩10min,以不加細胞培養(yǎng)液的空白對照孔調(diào)零,酶標儀檢測492 nm的吸光度值,每組8個復(fù)孔。增殖率=(實驗組吸光度值-對照組吸光度值)/對照組吸光度值×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 15.0處理數(shù)據(jù)。對不同時間點各組細胞存活率、增殖率及上清液中LDH含量的比較行單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞及其鑒定 見圖1。

圖1 體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞及其鑒定A:傳1代的星形膠質(zhì)細胞;B:星形膠質(zhì)細胞的鑒定(免疫細胞化學(xué)ABC,×200)。

2.2 各組細胞存活率比較 見表1。

表1 各組細胞存活率比較(n=7) %

2.3 各組細胞上清液中LDH含量比較 見表2。

表2 各組細胞上清液中LDH含量比較(n=7) U/L

2.4 各組細胞培養(yǎng)72 h后增殖率比較 見表3。

表3 各組細胞培養(yǎng)72 h后增殖率的比較 %

3 討論

星形膠質(zhì)細胞體內(nèi)有一種特異性的標志蛋白GFAP。該實驗中作者提取的神經(jīng)細胞經(jīng)GFAP免疫細胞染色鑒定證明其純度大于 95%,能夠達到研究的要求。

該研究結(jié)果顯示,培養(yǎng) 24、48及 72 h后酸性肽各組細胞存活率幾乎均高于相同條件的無血清組和胎牛血清對照組。培養(yǎng) 72 h后酸性肽各組細胞增殖率均高于無血清組和胎牛血清對照組,說明酸性肽對星形膠質(zhì)細胞的生長有營養(yǎng)和保護作用。

LDH是一種胞內(nèi)酶,廣泛存在于各種組織細胞中,正常情況下釋放很少,病理情況下細胞膜通透性增高或完整性喪失時,LDH漏出增加。因此,測定胞外LDH含量可以衡量細胞損傷的程度[7]。該實驗結(jié)果顯示,酸性肽各組培養(yǎng)上清中的 LDH含量都明顯低于相應(yīng)時間點的胎牛血清對照組,說明酸性肽對星形膠質(zhì)細胞的損傷作用遠遠低于體積分數(shù)20%的胎牛血清。

綜上所述,酸性肽對體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細胞的生長增殖具有一定的營養(yǎng)和保護作用。

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