趙 杰,薛文華,梁淑紅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科鄭州 450052 2)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所烏魯木齊 830004△男,1969年5月生,博士,副主任藥師,研究方向:臨床藥理學(xué),E-mail:zhaojie@zzu.edu.cn

唇形科植物中的香青蘭分布于我國東北、西北及華北等地區(qū),特別是新疆,資源豐富。香青蘭藥用全草為地上干燥部分,氣清香,葉微辛。香青蘭在民間用于治療冠心病及血液質(zhì)旺盛(高血壓)、寒性神經(jīng)性頭痛等疾病,療效確切。冠心病是常見病和多發(fā)病,心絞痛為本病的主要癥狀之一。研究[1]發(fā)現(xiàn),香青蘭二級溫?zé)?有很強的香味,具有補益心腦、活血化淤、通路開竅及止痛解毒之功效,全方位針對治療冠心病和心絞痛的綜合癥狀,確實能改善心肌缺血的狀況。為了進一步開發(fā)利用香青蘭,作者分別對香青蘭進行了系統(tǒng)分層溶劑萃取,分別得到總提取物層、氯仿層、乙酸乙酯層和正丁醇層,然后用體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞制備缺氧/復(fù)氧(hypoxia/ reoxygenation,H/R)損傷模型,觀察香青蘭不同提取部位對心肌細胞損傷的影響并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 香青蘭由新疆民族藥研究所提供;NaCl與KCl(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、KH2PO4、Na2HPO4、NaHCO3、NaH2PO4、MgSO4、CaCl2和NaHCO3(天津市化學(xué)試劑三廠);EDTA、二甲基亞砜、MTT、DMEM培養(yǎng)粉(高糖、低糖)和胰蛋白酶(美國Amresco公司);胎牛血清、鏈霉素(華北制藥股份有限公司);注射用氨芐西林鈉(中諾藥業(yè)有限公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(美國Gibco公司)。超聲細胞破碎儀(上海新芝生物技術(shù)研究所與寧海新芝科研所生產(chǎn)),酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Coulter公司生產(chǎn))。

1.2 香青蘭有效成分的提取 香青蘭全草500 g,粉碎,分別用體積分?jǐn)?shù)為 95%的乙醇回流提取 2次和體積分?jǐn)?shù) 50%的乙醇回流提取 1次,料液體積比1:10,每次 2 h,合并 3次的提取液,減壓濃縮回收溶劑得浸膏 150 g。再對浸膏進行分層萃取,具體流程參考文獻[2]。

1.3 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)[3]取出生 1～3 d的SD大鼠乳鼠(雌雄不限,由河南省實驗動物中心提供)。無菌條件下取出心臟后用冷PBS溶液洗凈心臟內(nèi)殘血,將心肌剪碎成 1 mm3左右的小塊,用培養(yǎng)基沖洗2～3次后,置組織于2.5 g/L胰蛋白酶中37℃分次消化,每次 10m in,收集上清液并用冷的體積分?jǐn)?shù) 10%的胎牛血清終止消化,反復(fù)吹打使細胞游離。消化液移入消毒的刻度離心管中, 1 000 r/min離心10 min,收集心肌細胞,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM懸浮,在37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)90min。以差速貼壁法去除已貼壁的成纖維細胞和其他雜質(zhì),將細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中,在 37℃體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下密閉培養(yǎng),24 h后更換全部的培養(yǎng)液,以后每 2～3 d更換培養(yǎng)液 1次,于試驗前 1 d換成無血清的培養(yǎng)基,待細胞處于對數(shù)生長期的時候開始實驗。

1.4 H/R損傷模型的建立[4]不含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液用體積分?jǐn)?shù)99.9%氮氣飽和30 min后,置換培養(yǎng)瓶中的正常含體積分?jǐn)?shù) 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,再向瓶內(nèi)充氮氣(1 L/m in) 90 s,以驅(qū)除瓶內(nèi)氧氣。然后塞緊瓶塞,密閉培養(yǎng) 2 h后,換用經(jīng)體積分?jǐn)?shù) 5%CO2飽和的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清正常含糖DMEM培養(yǎng)液,在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 min,建立H/R模型。

1.5 實驗分組 將培養(yǎng)的細胞于加藥前 1 d移入96孔板,并分為 6組(每組 10孔)。①正常對照組含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。②模型組:缺氧 2 h,復(fù)氧30 min。③總提取物組。④氯仿組。⑤乙酸乙酯組。⑥正丁醇組。各提取物組均在H/R后 1 h后加入相應(yīng)提取物,然后置于37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中24 h。

1.6 觀測指標(biāo)

1.6.1 細胞的存活情況 心肌細胞懸浮液以2× 106mL-1的密度接種于 96孔板,用含體積分?jǐn)?shù) 10%的胎牛血清培養(yǎng) 24 h后,用緩沖液沖洗2遍,后加入培養(yǎng)基和香青蘭的不同提取物,從單純培養(yǎng)液作對照,在37℃體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)24 h后,每孔加20μL的MTT,37℃孵育4 h,吸去上清液,每孔加二甲基亞砜 100μL,振蕩數(shù)分鐘使其充分混勻,在酶聯(lián)檢測儀上于570 nm處測定吸光度(A)值。

1.6.2 細胞活力 取少量心肌細胞懸液以0.4%的臺盼藍染料染色,著色細胞為死細胞,而活細胞拒染,在倒置顯微鏡下,用血球計數(shù)板分別計活細胞的數(shù)目和死細胞數(shù)。根據(jù)下式求細胞活力:細胞活力=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))×100%。

1.6.3 LDH活性 收集各組培養(yǎng)基,嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定LDH釋放量。

1.6.4 細胞內(nèi)MDA和SOD含量測定 MDA的測定采用硫代巴比妥酸顯色法,SOD的測定采用黃嘌呤氧化酶法,操作嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒說明書步驟。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0進行分析,各組所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗方差齊性檢驗;然后采用單因素方差分析及LSD-t檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 香青蘭提取物對H/R損傷的心肌細胞活力的影響 各組細胞活力和吸光度值均服從正態(tài)分布且總體方差齊,因此采用單因素方差分析,結(jié)果見表1。

表1 香青蘭提取物對H/R損傷心肌細胞活力的影響

2.2 香青蘭提取物對H/R損傷心肌細胞LDH、MDA和SOD活性的影響 各組LDH、MDA和SOD數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布且總體方差齊,因均采用單因素方差分析,結(jié)果見表 2。

表2 香青蘭提取物對H/R損傷心肌細胞LDH、M DA和SOD指標(biāo)活性的影響

3 討論

在細胞水平上,常以乳鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型模擬在體心肌缺血/再灌注損傷。作者在大鼠乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了心肌細胞H/R損傷的模型,心肌細胞缺氧 2 h,后復(fù)氧 30 min后,搏動減弱甚至停止,脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強,心肌細胞這些結(jié)構(gòu)和功能的改變與心臟缺血/再灌注損傷幾乎一致,可以較為真實的模擬缺血/再灌注損傷的病理生理過程[5]。

SOD是重要的抗氧化酶,其活性的高低反映心肌細胞抗氧化損傷的能力,MDA則是生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,其含量的變化反應(yīng)生物膜是否遭到過氧化損傷。缺氧時心肌細胞膜損傷,細胞膜的完整性遭到破壞,導(dǎo)致膜流動性下降,通透性增加,心肌細胞LDH將大量外漏。因此,測定細胞內(nèi)SOD活性、MDA含量和培養(yǎng)液LDH的釋放量可以反映細胞的受損程度。

作者的結(jié)果顯示:缺氧/復(fù)氧模型組與正常組比較,SOD活性下降,MDA含量、LDH活性明顯增加,提示造模成功;香青蘭不同提取物給藥組與H/R模型組比較,SOD活性升高,MDA含量、LDH活性降低,說明香青蘭提取物具有抑制H/R所引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),保護心肌細胞膜結(jié)構(gòu)完整性的作用。氯仿組和乙酸乙酯組SOD活性升高,MDA含量、LDH活性降低,其他組之間相比較而言差異顯著,總提取物組與正丁醇組對此沒有明顯的作用。此外,該研究香青蘭氯仿組和乙酸乙酯組可顯著提高細胞的存活率,減輕 H/R所致的細胞損傷,提示這2個萃取部位含有某種化學(xué)物質(zhì)能夠減輕 H/R對組織的損傷。有研究[6]報道稱氯仿萃取部位和乙酸乙酯萃取部位含有大量的黃酮類物質(zhì),黃酮類物質(zhì)具有降血脂等治療心腦血管疾病的作用。以上說明香青蘭氯仿組和乙酸乙酯組可能是通過黃酮類物質(zhì)降低H/R對組織的損傷。MTT進入活細胞,被氧化后形成藍色的結(jié)晶物,MTT法的A值即反應(yīng)心肌細胞的存活情況,又反應(yīng)心肌細胞內(nèi)線粒體脫氫酶的活性。該實驗中,H/R損傷模型組的心肌細胞的A值明顯下降,而預(yù)先加入香青蘭提取物后,MTT結(jié)晶量明顯增加,也提示香青蘭提取物對心肌細胞具有保護作用。

綜上所述:香青蘭的不同提取部位可以對抗 H/ R所引起的脂質(zhì)過氧化損傷,從而保護心肌細胞,尤其以氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位的作用最強。

[1]馮長根,李瓊.香青蘭化學(xué)成分與藥理活性研究綜述[J].中成藥,2003,25(2):155

[2]翟曉秋,劉云剛.大黃提取分離新技術(shù)研究進展[J].海峽藥學(xué),2007,19(10):4

[3]馮國清,劉潔,付潤芳.前列腺素E 1對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].河南醫(yī)學(xué)研究,1997,6(3):216

[4]婁建石,梁會旭,劉艷霞.硝酸甘油與丁丙諾啡合用抗大鼠心肌缺血的藥理性預(yù)適應(yīng)研究:早期心臟保護作用[J].中國藥理學(xué)通報,2003,9(10):1 119

[5]蔣詩琴,龔培力.二氫石蒜堿對大鼠乳鼠培養(yǎng)心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護作用[J].中國藥理學(xué)通報, 2005,21(8):999

[6]史春志,谷翔,黎明,等.大蒜素對培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷細胞凋亡的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2006,32 (1):54