張衛(wèi)軍，王作茂，渠鳳麗*

（1.湖南科技學(xué)院，湖南永州425100）

（2.曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東省生命有機分析重點實驗室，山東曲阜273165）

0 引言

汞元素是一種重金屬元素，以多種形態(tài)（游離態(tài)、無機和有機汞）存在于自然界中。二價汞離子（Hg2+）比一價汞離子（Hg+）更為常見，具有很強的腐蝕性和致癌性，是常見的環(huán)境污染物之一。有機汞（特別是甲基汞）可以在海洋生物體內(nèi)累積，能通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，導(dǎo)致大腦損傷和其它慢性疾病，最典型的例子就是在日本發(fā)生的水俁病[1]。因此，汞離子作為一種水體污染物的檢測就顯得非常重要。

目前很多分析方法已被用來測定汞離子，如原子吸收光譜法[2]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[3]、冷原子熒光光度法[4]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[5]、電化學(xué)方法[6]以及紫外可見光譜法[7]等。盡管這些方法的靈敏度比較高但都具有檢測成本高、樣品前處理復(fù)雜、費時，不適用于實時和現(xiàn)場檢測等缺點。由于熒光探針在選擇性、檢測成本等方面具有絕對的優(yōu)勢，目前設(shè)計和使用熒光探針來檢測汞離子引起了分析工作者的廣泛關(guān)注。

汞離子能和熒光分子自旋軌道進行耦合，猝滅熒光分子的熒光[8]，是一種常見的熒光猝滅劑。故大多數(shù)測定汞離子的熒光探針都是基于熒光猝滅機理進行的[9]，其靈敏度低于增強型的探針。但是在已經(jīng)報道熒光探針中，只有很少一部分是基于熒光增強原理來測定汞離子的[10]。因此，對熒光增強型汞離子探針的研究仍是一個比較活躍的領(lǐng)域，同時也是一個挑戰(zhàn)。羅丹明及其衍生物具有摩爾消光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高[11]、相對長的激發(fā)波長(＞500 nm)和發(fā)射波長等優(yōu)點，這些優(yōu)點使其具備了成為熒光探針載體的潛力。目前已經(jīng)報道了一些基于羅丹明的熒光探針，它們可以通過顏色和熒光信號的變化來檢測Cu2+[12],Pb2+[13],Cr3+[14]和Fe3+[15]等金屬離子。其檢測機理是離子加入前后探針的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化：加入離子之前探針以羅內(nèi)酰胺的結(jié)構(gòu)存在并且不顯示熒光，顏色為無色，加入離子之后探針的羅內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)被打開發(fā)出強的熒光，顏色變?yōu)榧t色；離子是通過可逆的配位反應(yīng)或不可逆的化學(xué)反應(yīng)使得探針的羅內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)被打開。利用上述原理，該文報道了一種基于羅丹明－噻吩類化合物的新型汞離子熒光探針，并對其測定的具體條件進行了研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所有的熒光測定在Perkin Elmer LS55熒光光譜儀上進行（激發(fā)狹縫：10.0 nm,發(fā)射狹縫:10.0 nm）；紫外可見光譜在UV-2450紫外儀上測定；核磁共振譜在Varian INOVA-400光譜儀上獲得（用CDCl3作溶劑），溶液的pH值用Mettler toledo delta 320 pH計測定。

2-氨乙基噻吩(TEA)購買于Alfa Aesar公司，羅丹明B從上海國藥集團有限公司購得。除特別指明外，其它的化學(xué)藥品都是分析純試劑，不需要進一步的純化和處理，可以直接使用。實驗過程中所用的水均為二次水。

1.2 化合物的合成

化合物1的合成路線見圖1。

圖1 化合物1的合成(a),甲醇,60℃,12 h,11%Fig.1 Synthesis of compound 1.(a)methanol，60℃,12 h,11%

化合物1(RBTEA)的合成：羅丹明B(96 mg,0.20 mmol)和2-氨乙基噻吩(25 mg,0.20 mmol)加入到15 mL的甲醇中，然后在60℃攪拌反應(yīng)12 h。混合物冷卻至室溫后減壓蒸餾去除溶劑，以二氯甲烷/乙醇(體積比為20∶1)為洗脫劑經(jīng)柱層析得到固體（1）12 mg，產(chǎn)率為11%。1H NMR(400 MHz,CDCl3),δ(ppm):1.16(t,J=7.2 Hz,12 H),2.68(t,J=8.0 Hz,2 H),3.31～3.39(m,10 H),6.25～6.27(m,2 H),6.40～6.45(m,4 H),6.34(d,J=2.4 Hz,1 H),6.80～6.82(m,1 H),7.01～7.03(m,1 H),7.09～7.12(m,1 H),7.44～7.46(m,2 H),7.91～7.93(m,1 H)。13C NMR(400 MHz,CDCl3):12.89,28.89,42.45,44.66,65.26,98.12,108.47,123.07,123.59,124.09,124.35,125.13,126.94,128.33,129.17,131.81,132.62,142.21,149.12,153.73,168.020。MS(ESI)m/z:552.3(M+H)。

1.3 熒光強度的測量

將適量的化合物1溶解于乙睛中制得5.0×10-5mol/L化合物1的標準溶液。

用pH為6.0的Tris-HNO3緩沖溶液逐級稀釋1.0×10-2mol/L硝酸汞溶液得到5×10-7～1×10-3mol/L Hg2+工作液。

不同pH的溶液是用HNO3或者NaOH調(diào)節(jié)0.05 mol/L Tris-HNO3溶液制得的。

在10 mL的容量瓶中加入4.0 mL 5.0×10-5mol/L化合物1的標準溶液和1.0 mL不同濃度的Hg2+溶液，然后用Tris-HNO3定容。這樣得到的溶液中含有2×10-5mol/L化合物1和5×10-8～1×10-4mol/L Hg2+，化合物1的空白溶液是在相同條件下制備的，但不加入Hg2+。所有溶液在4℃下避光保存，以備下一次使用。

熒光強度測定時，固定激發(fā)波長為520 nm，記錄540～650 nm范圍內(nèi)的熒光強度的變化。每次測量前，混合溶液放置5 min，以便絡(luò)合完全。

2 結(jié)果和討論

2.1 光譜性質(zhì)

在25℃，記錄探針1（2×10-5mol/L）在乙腈/水（體積比為1∶1）的0.05 mol/L Tris-HNO3（pH6.00）緩沖溶液中熒光發(fā)射光譜的變化。圖2是熒光探針1在不同濃度Hg2+溶液中的熒光發(fā)射光譜圖。

圖2 不同濃度的汞離子存在時化合物1(20 μmol/L)的熒光發(fā)射光譜圖(汞離子的濃度從1到12依次是0，0.05,0.1，0.25，0.5，1，2.5，5，10，25，50，100 μmol/L，實驗測定是在pH6.00的Tris-HNO3中測定)Fig.2 Changes of the fluorescence spectra of probe 1(20 μmol/L)in the prescence of various concentrations of Hg2+:0，0.05,0.1，0.25，0.5，1，2.5，5，10，25，50，100 μmol/L from 1 to 12(λex=520 nm).These spectra were measured in 0.05 mol/L Tris-HNO3buffer（pH6.00）

從圖2中可以看出：在Hg2+加入之前，化合物1在580 nm處有一個微弱的熒光發(fā)射峰；加入Hg2+之后，化合物1在該波長處的熒光發(fā)射強度顯著增加，并且該熒光發(fā)射強度隨著Hg2+濃度的增加而增加直至達到最大值。當過量的Hg2+存在時，化合物1在580 nm處的熒光發(fā)射強度增加了14.5倍。這些實驗結(jié)果表明化合物1和Hg2+發(fā)生了相互作用，該文正是基于此來測定Hg(Ⅱ)濃度的。

為了進一步弄明白化合物1和汞離子的響應(yīng)機理，進一步研究了探針1在Hg2+前后溶液的紫外吸收光譜，實驗結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出：沒有Hg2+存在時，化合物1在560 nm處有微弱的吸收峰，這說明化合物1在沒Hg2+存在時可能是以羅內(nèi)酰胺形式存在的；當存在10-5mol/L Hg2+時，化合物1在560 nm出現(xiàn)強的吸收峰，這說明Hg2+存在時化合物1的羅內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)可能被打開。紫外可見吸收光譜表明Hg2+和化合物1發(fā)生相互作用使得化合物1的羅內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)被打開。

2.2 測定原理

圖3 汞離子(20 μmol/L)加入前后化合物1(20 μmol/L)的紫外可見光譜圖（其中虛線表示加入Hg2+之前，實線表示加入Hg2+之后）Fig.3 UV-spectra of probe 1(20 μmol/L)before(…)and after(—)the addition of Hg2+(20 μmol/L)in pH6.0 Tris-HNO3buffer

圖4 log[(F-F0)/F0]和logcHg2+的關(guān)系曲線圖(F0和F分別代表加入汞離子前后化合物1的熒光強度值)Fig.4 Plot of log[(F-F0)/F0]as a function of the logcHg2+.F0and F are the fluorescence intensity of 1 in the absence and presence of Hg2+,respectively

如圖4所示，化合物1的熒光強度隨著汞離子濃度的增加而增加，當汞離子和化合物1物質(zhì)的量比為1∶2時其熒光強度保持不變。在汞離子濃度為5×10-8～1×10-5mol/L的范圍內(nèi)log[(F-F0)/F0]與logcHg2+呈良好的線性關(guān)系，其校正曲線可用式(1)表示：

其中r代表線性相關(guān)系數(shù)，F(xiàn)0指化合物1的空白溶液的熒光強度值,F代表加入汞離子之后化合物1的熒光強度值，cHg2+代表加入的汞離子濃度。經(jīng)熒光滴定曲線可計算Hg2+和化合物1的結(jié)合常數(shù)是7.50×105mol/L，檢測下限是2.0×10-8mol/L。

圖5 化合物1的Job曲線圖Fig.5 Job's plot for probe 1 in 0.05 mol/L tris-HNO3buffer(V(acetonitrile)∶V(water)=1∶1,pH6.00).The totalconcentration of 1 and Hg2+was 30 μmol/L(λex=520 nm)

為了更好地研究化合物1與汞離子的配比，研究了Job曲線圖。實驗結(jié)果見圖5。從圖5可以看出當汞離子的摩爾百分比在0.33時化合物1的熒光強度達到最大值，這也表明汞離子和化合物1是以1∶2配位的。因此，提出了化合物1和汞離子形成2∶1絡(luò)合物的可能結(jié)構(gòu)模型（如圖6所示）。

圖6 化合物1和汞離子可能的結(jié)合模型Fig.6 Possible coordination mode for probe 1 with Hg2+

2.3 pH的影響

圖7顯示了加入汞離子（濃度為1×10-5mol/L）前后不同的pH值對化合物1熒光強度的影響。

圖7 不同pH值在加入Hg2+前后對化合物1熒光發(fā)射強度的影響（其中實線表示加入Hg(Ⅱ)之前，虛線表示加入Hg2+之后，Hg(Ⅱ)的濃度固定在10 μmol/L）Fig.7 pH dependence of the fluorescence intensity of 20 μmol/L probe 1 in the absence and presence of Hg2+.The excitation wavelength was 520 nm

從圖7中可以看出，當沒有Hg2+時化合物1的熒光強度在pH(4～12)之間保持不變；在pH小于4時化合物1的熒光強度隨pH的減少而增加，這可能在強酸性條件下化合物1的羅內(nèi)酰胺開環(huán)導(dǎo)致其熒光增強。當存在1×10-5mol/L Hg2+時化合物1的熒光強度在pH(4～7)之間保持不變；當pH(7～8)之間，熒光強度隨pH的增加而減小，這可能是在堿性條件下，Hg2+會形成Hg(OH)2，從而減少了其和化合物1的配位；在pH(8～12)之間熒光強度基本保持不變且和pH(4～12)之間不加Hg2+的化合物1的熒光差不多。這些實驗結(jié)果表明，在pH(4～7)范圍內(nèi)，化合物1對Hg2+的測量不受pH的影響。考慮到靈敏度和反應(yīng)速度，選擇pH6.0的Tris-HNO3為最佳實驗條件。

2.4 選擇性

研究了探針1（2×10-5mol/L）在不同金屬陽離子（1×10-5mol/L）單獨存在時熒光發(fā)射強度的變化，從而探討探針1對汞離子的選擇性，實驗結(jié)果見圖8黑色柱狀圖。從圖8的黑色柱狀圖中可以看出，當Hg2+加入時探針1的熒光強度大大增強，而加入Cu2+后，探針1的熒光強度有微弱的增強。其它離子對探針1的熒光強度基本沒有影響。進一步考察了在其它金屬離子和汞離子共存時對汞離子測定的影響，如圖8的白色柱狀圖。從圖8的白色柱狀圖中可以看出，除了Cu2+，其它金屬離子對Hg2+的測定基本沒影響。因此，除銅離子干擾外，化合物1對汞離子有好的選擇性。

圖8 化合物1對金屬離子的選擇性（所有離子的濃度均為10 μmol/L，黑色柱狀圖代表加入不同的金屬離子，白色柱狀圖代表在汞離子存在時加入不同的金屬離子）Fig.8 Metal ion selectivity of probe 1(20 μmol/L).All data were obtained at pH6.0 Tris-HNO3buffer(V(acetonitrile)∶V(water)=1∶1).The conentration of ions added to probe 1 was10 μmol/L for all ions.The excitation wavelength was 520 nm.Black bars:different metal ions were added.White bars:different metal ions in the presence of Hg2+were added

2.5 初步的分析應(yīng)用

將所制備的熒光探針用于湘江水及自來水中汞離子回收率的測定。湘江水和自來水在經(jīng)簡單過濾處理后用所制熒光探針測定汞離子含量，得知其中不含汞離子，然后分別加入不同濃度的Hg2+的標準溶液。結(jié)果列于表1。從表1中可以看出，該熒光探針對湘江水及自來水中Hg2+回收率的測定結(jié)果令人滿意，所以該探針可用于實際樣品中Hg2+的分析測定。

表1 湘江水和自來水的回收率實驗Tab.1 Determination of Hg2+in tap and river water samples with probe 1

3 結(jié)論

該文制備了一個基于羅丹明－噻吩類化合物的汞離子熒光探針，當汞離子存在時該探針熒光發(fā)射強度增強同時溶液由無色變?yōu)榉奂t色，從而實現(xiàn)Hg2+的選擇性識別。該探針對Hg2+的線性響應(yīng)范圍是5×10-8～1×10-5mol/L，檢測下限是2.0×10-8mol/L，pH工作范圍是4.0到7.0。該探針對汞離子檢測具有較高的靈敏度和較好的選擇性，已被用于檢測自來水和河水中的汞離子，測定結(jié)果令人滿意。

[1]Petanen T,Romantschuk M.Use of bioluminescent bacterial sensors as an alternative method for measuring heavy metals in soil extracts[J].Analytica Chimica Acta,2002,456(1):55～61.

[2]Tseng C M,De Diego A,Martin F M,et al.Rapid determination of inorganic mercury and methylmercury in biological reference materials by hydride generation,cryofocusing,atomic absorption spectrometry after open focused microwave-assistedalkalinedigestion[J].Journal of Analytical Atomic Spectrometry,1997,12(7):743～750.

[3]Li Y,Chen C,Li B,et al.Elimination efficiency of different reagents for the memory effect of mercury using ICPMS[J].Journal of Analytical Atomic Spectrometry,2206,21(1):94～96.

[4]Vallant B,Kadnar R,Goessler W.Development of a new HPLC method for the determination of inorganic and methylmercury in biological samples with ICP-MS detection[J].Journal of Analytical Atomic Spectrometry,2007,22(3):322～325.

[5]Chen Y W,Tong J,D'Ulivo A,et al.Determination of mercury by continuous flow cold vapor atomic fluorescence spectrometry using micromolar concentration of sodium tetrahyroborate as reductant solution[J].Analyst,2002,127(11):1 541～1 546.

[6]Anthemidis A N,Zachariadis G A,Michos C E,et al.Time-based on-line preconcentration cold vapour generation procedure for ultra-trace mercury determination with inductively coupled plasma atomic emission spectrometry[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2004,379(5-6):764～769.

[7]Perez-Marin L,Otazo-Sanchez E,Macedo-Miranda G,et al.Mercury(Ⅱ)ion-selective electrode.Study of 1,3-diphenylthiourea as ionophore[J].Analyst,2000,125(10):1 787～1 790.

[8]Tan J,Yan X P.2,1,3-Benzoxadiazole-based selective chromogenic chemosensor for rapid naked-eye detection of Hg2+and Cu2+[J].Talanta,2008,76(1):9～14.

[9]McClure D S.Spin-orbitinteractioninaromatic molecules[J].The Journal of Chemical Physics,1952,20(4):682～686.

[10]Metivier R,Leray I,Valeur B.Lead and mercury sensing by calixarene-based fluoroionophores bearing two or four dansyl fluorophores[J].Chemistry-A European Journal,2004,10(18):4 480～4 490.

[11]Nolan E M,Lippard S J.A“turn-on”fluorescent sensor for the selective detection of mercuric ion in aqueous me-dia[J].Journal of the American Chemical Society,2003,125(47):14 270～14 271.

[12]Lakowicz J R.Principles of Fluorescence Spectroscopy,3rd ed[M].Springer:New York,2006;pp 67～69.

[13]Swamy K M K,Ko S K,Kwon S K,et al.Boronic acidlinked fluorescent and colorimetric probes for copper ions[J].Chemical Communications,2008,(45):5 915～5 917.

[14]Kwon J Y,Jang Y J,Lee Y J,et al.A highly selective fluorescent chemosensor for Pb2+[J].Journal of the American Chemical Society,2005,127(28):10 107～10 111.

[15]Mao J,Wang L,Dou W,et al.Tuning the selectivity of two chemosensors to Fe(Ⅲ)and Cr(Ⅲ)[J].Organic Letters,2007,9(22):4 567～4 570.