王青，薛曹葉，羊小海，王柯敏

（化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，湖南大學化學化工學院，生物納米與分子工程湖南省重點實驗室，湖南長沙410082）

0 引言

鋅離子是人體內含量僅次于鐵的過渡金屬，在許多生理，生化過程中發(fā)揮極為重要的作用。鋅離子的濃度與多種疾病的發(fā)生緊密相關[1]。鋅離子活性降低會引起神經元損傷，細胞凋亡也與鋅離子有關。但如果鋅的攝入過量，將會造成鋅中毒。長期過量攝取含鋅食物會影響銅代謝，造成低銅，鋅、銅比值過高，可影響膽固醇代謝，形成高膽固醇血癥，最終導致動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等。因此檢測鋅離子具有重要的意義。

目前鋅離子的主要檢測方法有原子吸收光譜法[2]，分光光度法[3]，離子色譜法[4]等，其中原子吸收光譜法靈敏度最高，但是這些方法儀器昂貴、操作繁瑣，成本太高不利于普及。熒光法用于測定鋅離子具有選擇性好、靈敏度高、簡便、快捷等優(yōu)點，已經設計并合成出很多發(fā)光機理不同的熒光探針[5～6]。在溶液檢測中，Yang等[7]構造了卟啉/β-環(huán)糊精超分子傳感器，隨著鋅離子濃度增加，卟啉的熒光強度比例（I606/I656）逐漸增加，該方法對鋅離子有良好的特異性。Hall等將鋅離子受體氮雜環(huán)修飾到CdSe/ZnS核/殼量子點上，通過鋅離子結合對量子點熒光強度的影響可以對鋅離子進行定量檢測，檢測下限為2.4 μmol/L[8]。在細胞內外游離鋅離子檢測中，N-(6-me-thoxy-8-quinolyl)-p-toluene-sulfonamide（TSQ）廣泛用于對細胞中的鋅離子熒光成像。Gee等[9]合成了一種新的可見光激發(fā)的鋅離子敏感型熒光探針FluoZin-3，成功用于胰腺β-細胞分泌鋅離子的檢測和成像。Tomat等[10]用Zinpyr標記的AGT融合蛋白對活細胞中的鋅離子進行了檢測。雖然已有的鋅離子熒光探針有很多優(yōu)勢，但是它們都涉及到復雜的有機分子合成過程，成本較高，不利于普及。

S1核酸酶是能夠特異性切割核酸單鏈的核酸酶，對鋅離子有很強的依賴性，基于此特性發(fā)展了一種基于分子信標和S1核酸酶的鋅離子檢測新方法。該方法操作簡便，不需要昂貴儀器，不涉及復雜的離子載體合成，對鋅離子的檢測下限為120 μmol/L。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

F-4500熒光分光光度計(Hitachi，日本)；恒溫循環(huán)水浴(Amersham Biosciences公司，美國)；超純水裝置（Elix3，Millipore，U.S.A）。

分子信標序列：5'-TAMRA-CAT CTT GGA TTG CAT CAA AAA GAT TAA GAG ACC AAT CCA AGA TG-DABCYL-3'為色譜純化，由大連寶生物（Takara）公司合成與純化；S1核酸酶購買于大連寶生物（Takara）公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、硫酸鋅、氯化鈉均為國產分析純。所有溶液均用Milli-Q超純水（18.2 MΩ·cm）配制，實驗中所有配制樣品溶液的水和緩沖溶液均經過高溫滅菌處理。

1.2 可行性的考察

取95 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，50 mmol/L NaCl），然后依次加入2 μL分子信標（終濃度為100 nmol/L）、2 μL不同濃度ZnSO4鋅離子和1 μL S1核酸酶（終濃度為0.018 U/μL），并實時監(jiān)測溶液熒光信號變化。激發(fā)波長為521 nm、發(fā)射波長為578 nm、激發(fā)狹縫為5 nm、發(fā)射狹縫為5 nm，所有檢測均在60℃下進行。

1.3 Na+濃度的優(yōu)化

取98 μL不同NaCl濃度的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4），加入2 μL分子信標，使其終濃度為100 nmol/L，實時監(jiān)測分子信標的背景熒光信號。

1.4 S1核酸酶濃度的優(yōu)化

每個待測的S1核酸酶濃度下設置一個檢測樣品和一個對照樣品。

檢測樣品：取95 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL分子信標（終濃度為100 nmol/L）、2 μL ZnSO4（終濃度為1 mmol/L）和1 μL不同濃度的S1核酸酶，并實時監(jiān)測溶液熒光信號變化。

對照樣品：取97 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL分子信標（終濃度為100 nmol/L）和1 μL不同濃度的S1核酸酶，并實時監(jiān)測溶液熒光信號變化。

依照公式V0=（F1-F0）/t計算出檢測樣品和對照樣品的反應初速度（V0）差，其中F0是加入S1核酸酶前分子信標的熒光強度，F1是加入S1核酸酶后反應時間為t的熒光強度，這里t取200 s。

1.5 分子信標濃度的優(yōu)化

每個待測的分子信標濃度下設計一個檢測樣品和一個對照樣品。

檢測樣品：取95 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL不同濃度的分子信標、2 μL ZnSO4（終濃度為2 mmol/L）和1μLS1核酸酶（終濃度為0.018U/μL），并實時監(jiān)測溶液熒光信號變化。

對照樣品：取97 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL不同濃度的分子信標和1 μL S1核酸酶（終濃度為0.018 U/μL），并實時監(jiān)測溶液熒光信號變化。

計算出檢測樣品和對照樣品的反應初速度之差。

1.6 鋅離子的檢測

取88 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入5 μL分子信標（終濃度為500 nmol/L）、5 μL不同濃度ZnSO4、2 μL S1核酸酶（終濃度為0.045 U/μL），并實時監(jiān)測S1核酸酶切割分子信標的熒光信號。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

原理如圖1所示。S1核酸酶特異性切割核酸單鏈，它的活性對鋅離子有很強的依賴性，溶液中的分子信標維持莖環(huán)結構，熒光基團與熄滅基團靠近，熒光被熄滅，加入S1核酸酶可以切割分子信標的環(huán)部，導致熒光基團和熄滅基團遠離，溶液中鋅離子濃度越高，S1核酸酶切割分子信標速率越快，熒光增強速度越快，通過建立熒光增強的速率和鋅離子濃度的標準曲線，就可以定量溶液中的鋅離子濃度。

圖1 基于分子信標和S1核酸酶檢測鋅離子原理圖Fig.1 Schematic diagram of Detection of zinc Based on molecular beacon and S1 nuclease

2.2 可行性考察

在不同鋅離子條件下用S1核酸酶對分子信標進行了切割，如圖2所示，隨著鋅離子濃度增加，S1酶切割分子信標的速率加快，說明該方法可以用來檢測鋅離子濃度。但是分子信標的背景熒光較高，影響了檢測效果，因此，后面需要對檢測條件進行優(yōu)化。

圖2 不同鋅離子條件下S1核酸酶切割分子信標熒光圖(a)0 mmol/L鋅離子;(b)0.4 mmol/L鋅離子Fig.2 The real-time fluorescence scan curve of S1 nuclease cut molecular beacon with different zinc concentration(a)0 mmol/L zinc;(b)0.4 mmol/L zinc

2.3 Na+濃度的優(yōu)化

分子信標需要在一定的離子強度條件下才能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結構，一般緩沖體系中會加入Mg2+。由于鋅離子是一種二價陽離子，所以檢測體系中沒有引入Mg2+和其它二價陽離子，只用Na+調節(jié)緩沖體系的離子強度，因此對Na+濃度進行了優(yōu)化，不同Na+濃度下分子信標的熒光掃描結果如圖3所示，隨著Na+濃度的增加，分子信標的背景熒光不斷降低，但為了減少陽離子對檢測的干擾，選擇可以穩(wěn)定分子信標構象的最低的離子強度，如圖3所示，當Na+濃度達到300 mmol/L時，分子信標的背景熒光非常低，并且迅速達到平衡，說明300 mmol/L的NaCl可以很好地穩(wěn)定分子信標的構象，因此選擇300 mmol/L為檢測時的Na+濃度。

圖3 Na+濃度對分子信標背景熒光的影響圖中曲線1～4的NaCl濃度分別依次為300、200、150、50 mmol/LFig.3 The fluorescence of molecular beacon with different Na+concentration From 1 to 4,the concentration of NaCl is 300,200,150,50 mmol/L

2.4 S1核酸酶濃度的優(yōu)化

S1核酸酶濃度越大，切割分子信標速度越快，但是產生的背景越高，因此需要對S1核酸酶濃度優(yōu)化其用量，如圖4所示，圖4A-D為不同S1核酸酶濃度下切割分子信標的實時熒光圖，曲線1和2的鋅離子濃度分別為1和0 mmol/L，圖4E為計算出來的不同濃度S1核酸酶的反應初速度增加值，可以看出S1核酸酶濃度為0.045 U/μL時，加入ZnSO4反應初速率增加最大，因此選擇0.045 U/μL的S1核酸酶為檢測的S1核酸酶濃度。

圖4 S1核酸酶濃度的選擇（A-D）酶切實時熒光圖，S1核酸酶濃度從A到D分別為0.018、0.045、0.09、0.18 U/μL，曲線1和2的Zn2+濃度分別為1和0 mmol/L；（E）酶切反應初速度增加值Fig.4 The selection of the concentration of S1 nuclease(A-D)The real-time fluorescence scan of hydrolize,from A to D,the concentration of S1 nuclease is 0.018,0.045,0.09,0.18 U/μL,respectively.Curve 1 and 2 indicate 1 and 0 mmol/L Zn2+;(E)The initial increased reaction velocity

2.5 分子信標濃度的優(yōu)化

圖5 分子信標濃度的選擇（A-D）酶切實時熒光曲線，MB濃度從A到D依次為50、100、150、500 nmol/L，曲線1和2的Zn2+濃度分別為2和0 mmol/L；(E)酶切反應初速度增加值Fig.5 The selection of the concentration of molecular beacon（A-D）The real-time fluorescence scan of hydrolize,from A to D,the concentration of molecular beacon is 50,100,150,500 nmol/L,curve 1 and 2 indicate 2 and 0 mmol/L Zn2+;(E)The increased initial reaction velocity

分子信標濃度太低，檢測信號就會不明顯，濃度過高，背景熒光也會上升，且提高了檢測成本，因此對分子信標濃度進行了優(yōu)化。圖5A-D為S1核酸酶切割不同濃度分子信標的實時熒光掃描圖，曲線1和2的鋅離子濃度分別為1和0 mmol/L，隨著分子信標濃度增加，信號和背景熒光均增加，兩者之差也增加，圖5E為計算出來的S1核酸酶切割不同濃度分子信標的反應初速率增加值，可以看出隨著分子信標濃度不斷增加，S1核酸酶切割的反應初速率增加值不斷增大，當分子信標濃度為500 nmol/L時，S1核酸酶切割的速率增加值達到0.803，此時絕對熒光值比較適中，并且考慮到檢測成本，不再選擇更高的分子信標濃度。因此選擇500 nmol/L的分子信標為檢測時的分子信標濃度。

2.6 鋅離子的定量檢測

用分子信標和S1核酸酶定量檢測鋅離子的結果如圖6所示。其中，圖6A為鋅離子檢測的實時熒光圖，隨著鋅離子濃度增加，熒光增強的速度加快，不加鋅離子時，S1核酸酶仍對分子信標有一定的酶切作用，這限制了鋅離子的檢測下限進一步降低。該背景可能是S1核酸酶的作用不是絕對依賴鋅離子造成的。圖6B為鋅離子濃度和酶切反應初速度繪制的標準曲線，顯示該方法對鋅離子檢測的檢測下限為120 μmol/L。

圖6 用分子信標和S1核酸酶檢測鋅離子(A)用分子信標和S1核酸酶檢測不同濃度鋅離子的熒光時間掃描曲線，從上到下，鋅離子濃度依次為2.0、1.5、1.0、0.50、0.25、0.12、0 mmol/L；(B)檢測不同濃度鋅離子的反應初速度標準曲線Fig.6 Detection of zinc with molecular beacon and S1 nuclease(A)The real-time fluorescence scan of different concentration of zinc,from up to down,the concentration of zinc is 2.0,1.5,1.0,0.50,0.25,0.12,0 mmol/L;(B)The initial velocity of different concentration of zinc

3 結論

借助于S1核酸酶特異性切割單鏈DNA，其活性對鋅離子濃度有依賴性，發(fā)展了一種基于分子信標和S1核酸酶的鋅離子檢測新方法，該方法操作簡便，無需昂貴儀器，也不涉及復雜的離子載體合成，對鋅離子的檢測下限為120 μmol/L。

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