田豐偉，孟 甜，丁俊榮，劉小鳴，張 灝，陳 衛(wèi)*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

蔬菜發(fā)酵劑乳酸菌產(chǎn)生物胺的檢測(cè)與評(píng)價(jià)

田豐偉，孟 甜，丁俊榮，劉小鳴，張 灝，陳 衛(wèi)*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

通過(guò)聯(lián)合采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和高效液相色譜分析(HPLC)技術(shù)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的60余株擬準(zhǔn)備用于蔬菜發(fā)酵的乳酸菌形成生物胺的能力和水平進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)。氨基酸脫羧酶基因的PCR檢測(cè)結(jié)果表明，受檢菌株中有3株組氨酸脫羧酶陽(yáng)性菌和22株酪氨酸脫羧酶陽(yáng)性菌；同時(shí)，利用HPLC法對(duì)受檢乳酸菌在MRS培養(yǎng)基體系和模式蔬菜發(fā)酵體系中發(fā)酵形成生物胺的水平進(jìn)行分析。受試乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中組胺產(chǎn)生量在4.32～32.15mg/L之間，酪胺產(chǎn)生量在9.22～114.02mg/L之間。在發(fā)酵蔬菜體系中，組胺和酪胺的產(chǎn)生量均小于40mg/L。PCR檢測(cè)結(jié)果與HPLC分析結(jié)果具有較好的一致性。

乳酸菌；發(fā)酵蔬菜；生物胺；組胺；酪胺；氨基酸脫羧酶；檢測(cè)

生物胺是氨基酸在微生物脫羧酶作用下形成的一類堿性低分子質(zhì)量有機(jī)物。食品中生物胺主要是由氨基酸經(jīng)乳酸菌脫羧形成，而且高濃度的生物胺往往出現(xiàn)在發(fā)酵食品中[1]。適量生物胺在體內(nèi)具有特定的生理活性，過(guò)量攝入時(shí)會(huì)損害健康[2]。Nout等[3]指出組胺和酪胺的最大攝入量應(yīng)該為50～100mg/kg和100～800mg/kg，酪胺的攝入量超過(guò)1080mg/kg會(huì)引起嚴(yán)重中毒。除了組胺、酪胺本身的作用外，其他生物胺的存在會(huì)增強(qiáng)組胺和酪胺的不良作用。因此，很難確定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量生物胺的毒性[4]。目前各國(guó)都沒有明確的最大攝入量規(guī)定[5]。生物胺是影響發(fā)酵和腌制蔬菜產(chǎn)品安全的一個(gè)主要風(fēng)險(xiǎn)因素。如何有效檢測(cè)與評(píng)價(jià)乳酸菌產(chǎn)生物胺的能力是開發(fā)蔬菜發(fā)酵劑時(shí)所必須要考慮的一個(gè)問(wèn)題。

目前生物胺的檢測(cè)方法主要包括微生物學(xué)方法、化學(xué)法和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)微生物學(xué)方法檢測(cè)生物胺產(chǎn)生菌是繁瑣且不準(zhǔn)確的，有報(bào)道稱乳酸菌在長(zhǎng)期保藏中或在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)可能會(huì)喪失產(chǎn)生生物胺的能力[6-7]，可能導(dǎo)致使用化學(xué)法定量檢測(cè)也有失偏頗，而分子生物學(xué)方法快速可靠且不依靠培養(yǎng)基，正彌補(bǔ)了其他方法的不足。因?yàn)樯锇肥敲擊让缸饔糜诎被崆绑w而最終形成的，所以分子生物學(xué)法以編碼脫羧酶的基因?yàn)槟繕?biāo)物進(jìn)行檢測(cè)與研究。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法具有簡(jiǎn)便、快速、敏感和專一等特點(diǎn)，已經(jīng)成為重要的氨基酸脫羧酶基因的檢測(cè)方法[8]。以實(shí)驗(yàn)室保藏的60余株乳酸菌為檢測(cè)對(duì)象，采用PCR技術(shù)對(duì)其基因組片段進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)其氨基酸脫羧酶基因，并利用HPLC法對(duì)乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中和蔬菜發(fā)酵模式體系中產(chǎn)生物胺的情況進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，為蔬菜發(fā)酵劑乳酸菌的開發(fā)與應(yīng)用提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)和雙歧菌屬(Bifidobacterium)等60余株乳酸菌，由江南大學(xué)中國(guó)工業(yè)微生物資源和信息中心、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)和江南大學(xué)食品生物技術(shù)研究室提供；酪氨酸脫羧酶陽(yáng)性對(duì)照菌短乳桿菌(L. brevis IOEB 9809) 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)；組氨酸脫羧酶陽(yáng)性菌彎曲乳桿菌(L. curvatus GY2512)為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)自不同發(fā)酵來(lái)源，種屬分類、生化性質(zhì)明確。

1.1.2 培養(yǎng)基與材料

MRS液體培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；卷心菜 市售。

1.1.3 試劑

蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、氯化鈉、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、檸檬酸銨、K2HPO4、MgSO4、MnSO4國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PCR引物PHDC1/PHDC2(up:5′CCGTGCG GAAACAAAGAAT3′/down:5′CCA AACACCAGC ATCTTCA3′)[9]，P2-for/P1-rev(up:5′GAYATIATI GGIATIGGIYTIGAYCARG3′/down:5′CCRTART CIGGIATIGCRAARTCIGTRTG3′)[9]上海博尚生物技術(shù)有限公司；Taq酶、dNTPs 上海皓嘉生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒(EZ-10 Spin Column Genomic DNA Isolation Kit) 上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

于超低溫冰箱中將甘油保藏乳酸菌取出，以1%體積分?jǐn)?shù)的接種量接種于10mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，傳代兩次，活化乳酸菌備用。

1.2.2 模式蔬菜發(fā)酵體系

卷心菜是發(fā)酵蔬菜最常用的蔬菜品種，因此選擇卷心菜作為模式蔬菜發(fā)酵體系，其具體制作方法如下，選擇潔凈無(wú)腐爛的新鮮卷心菜，經(jīng)清洗、切分、打漿、取汁，離心去除不溶性固形物，然后經(jīng)115℃殺菌20min，冷卻后以體積分?jǐn)?shù)2%比例接種待測(cè)乳酸菌，于37℃發(fā)酵12h，待測(cè)。

1.2.3 基因組DNA提取

按照基因組提取試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4PCR檢測(cè)脫羧酶基因

據(jù)報(bào)道，酪胺和組胺是發(fā)酵蔬菜中主要的生物胺，因此選擇酪氨酸脫羧酶基因和組氨酸脫羧酶基因作為檢測(cè)目標(biāo)。選擇25μL擴(kuò)增體系：10×buffer 2.5μL，引物(PHDC1/PHDC2，P2-for/P1-rev)1μL，dNTPs 2.5μL，Taq酶0.5μL，模板DNA1μL。將上述反應(yīng)液按順序加入0.2mL離心管中，以無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足至25μL，充分混勻，擴(kuò)增反應(yīng)條件：組氨酸脫羧酶PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性，5min；循環(huán)數(shù)：30；95℃變性，45s；50℃退火，1min；72℃延伸，35s；72℃終延伸，10min。酪氨酸脫羧酶PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性，5min；循環(huán)數(shù)：30；95℃變性，45s；55℃退火，1min；72℃延伸，56s；72℃終延伸，10min。

1.2.5PCR產(chǎn)物回收測(cè)序及同源性分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)柱式膠回收試劑盒純化后送樣到上海生工測(cè)序，測(cè)定結(jié)果使用NCBI上的Blast進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

1.2.6 生物胺的HPLC分析[10]

樣品前處理：樣品與0.06g/mL三氯乙酸等體積混合，靜置提取1h，雙層濾紙過(guò)濾，待衍生。

色譜條件：Waters symmetry C18色譜柱(4.6mm× 250mm，5μm)，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序(表1)；流速：1.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：35℃。

表1 HPLC法檢測(cè)生物胺的改進(jìn)梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program for biological amine analysis

生物胺混合標(biāo)樣衍生[11]：取2mL標(biāo)樣加入1mL 2mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值至堿性，加入10μL苯甲酰氯水浴30℃衍生處理40min，而后加入2mL飽和NaCl溶液 60℃水浴5min終止衍生化，加3mL乙醚振蕩混合，萃取完全后移取上層有機(jī)相至干凈試管，用氮?dú)獯蹈珊?，?mL甲醇溶解，每個(gè)樣品5次平行，取20μL進(jìn)樣測(cè)定生物胺含量。

樣品衍生：衍生步驟同上，衍生后取20μL進(jìn)樣測(cè)定生物胺含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別從生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中準(zhǔn)確量取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，配制成0、1.00、5.00、10.0、25.0、50.0mg/L等一系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用上述方法衍生，測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定5次。采用外標(biāo)法，將5種生物胺峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制校準(zhǔn)曲線，各種生物胺的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)見表2。分析結(jié)果表明，該HPLC法測(cè)定的4種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，在1.00～50.0mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2＞0.998)，證明該方法對(duì)測(cè)定4種生物胺具有良好的可靠性。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程與相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations and correlation coefficients

2.2 組氨酸和酪氨酸脫羧酶基因的PCR檢測(cè)和生物胺的HPLC分析結(jié)果

再按照試劑盒操作要求進(jìn)行，提取待檢測(cè)乳酸菌菌的基因組，再進(jìn)行電泳驗(yàn)證，60余株乳酸菌均得到大小約為2Mb的較清晰的基因組條帶。

以PHDC1/PHDC2、P2-for/ P1-rev為引物，以乳酸菌基因組DNA為模板分別檢測(cè)組氨酸和酪氨酸脫羧酶基因，圖1為部分菌株目的脫羧酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，分別擴(kuò)增出500bp和900bp左右的條帶。

對(duì)組氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)。表明L.helveticus T16、Lceuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 12273、Bifidobacterium bifidum BCRC14615擴(kuò)增出的序列與Lactobacillus reuteri JCM 1112、Lactobacillus reuteri DSM 20016、Lactobacillus sp. 30a的組氨酸脫羧酶基因序列高度同源，同源性分別高達(dá)98%、98%、97%，表明該擴(kuò)增產(chǎn)物是組氨酸脫羧酶基因。Lactobacillus helveticus C1302、Lactobacillus helveticus D1401，Bifidobacerium bifidum BB-20等22個(gè)菌株擴(kuò)增出的序列與Enterococcus faecium、Enterococcus faecium strain Ef1、Enterococcus faecium strain Ef2 的酪氨酸脫羧酶基因序列高度同源，同源性均高于97%，證明該擴(kuò)增產(chǎn)物是酪氨酸脫羧酶基因。

圖1 PCR法檢測(cè)組氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶基因Fig.1 PCR method to detect the genes of histidine decarboxylase and tyrosine decarboxylation enzyme

對(duì)待測(cè)乳酸菌在MRS培養(yǎng)基和發(fā)酵卷心菜中產(chǎn)生物胺的量進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果見表3。待測(cè)乳酸菌產(chǎn)生物胺的HPLC分離效果色譜圖如圖2所示。

圖2 生物胺分離效果色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram for a standard mixture of biological amine

表3和圖2結(jié)果表明，在受試菌中有3個(gè)菌株具有產(chǎn)組胺的能力，而具有產(chǎn)酪胺能力的菌株為22株，但是不同的菌株生成酪胺的能力差別較大，其原因可能在于酪胺的形成除了受本身基因的影響之外還受基質(zhì)和環(huán)境條件的影響。因?yàn)楫a(chǎn)生生物胺必須包括以下3個(gè)條件：存在生成生物胺的前體氨基酸；存在含有氨基酸脫羧酶的微生物；有適宜的環(huán)境條件[12]。也就是說(shuō)有些菌株雖然含有氨基酸脫羧酶基因，但不一定會(huì)產(chǎn)生生物胺，還要看是否存在利于產(chǎn)生生物胺的條件。發(fā)酵食品中生物胺除去外源性微生物污染外，自身發(fā)酵劑的使用不當(dāng)或發(fā)酵環(huán)境的控制不好都會(huì)引起其在食品中的積累而達(dá)到或超過(guò)安全限[13]。

生物胺是通過(guò)底物和酶反應(yīng)生成的，廣泛存在于各類食品中，在富含蛋白質(zhì)和氨基酸的食品中相對(duì)更多[14]。據(jù)報(bào)道，雖然可產(chǎn)生生物胺的微生物并不是廣泛的分布在各個(gè)種屬，但是幾乎每個(gè)種屬都存在產(chǎn)生物胺的菌株，并沒有種屬特異性。但其產(chǎn)生的量卻千差萬(wàn)別[15]。此外，食品中生物胺的產(chǎn)生與不良的衛(wèi)生環(huán)境和儲(chǔ)藏條件有關(guān)，所以采取相應(yīng)的措施就可以避免生物胺的產(chǎn)生[16]。未來(lái)需要進(jìn)一步開展關(guān)于乳酸菌產(chǎn)生生物胺條件的研究。

通過(guò)對(duì)NCBI上已報(bào)道的乳酸菌組氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶的蛋白和基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同種屬乳酸菌脫羧酶的基因序列高度保守。因此，通過(guò)設(shè)計(jì)合適引物來(lái)對(duì)乳酸菌脫羧酶基因進(jìn)行PCR檢測(cè)是檢測(cè)乳酸菌產(chǎn)生物胺可能性的一種快速高效的檢測(cè)方法[9]。PCR檢測(cè)表征了乳酸菌是否具有產(chǎn)生物胺的潛在能力，HPLC分析結(jié)果直接定量表示發(fā)酵體系中有無(wú)生物胺的形成或高低，二種方法結(jié)合使用能很好的對(duì)乳酸菌產(chǎn)生物胺的能力和水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。在本研究中，對(duì)受試菌株而言，PCR結(jié)果與HPLC檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性，因此可以綜合采用兩種方法對(duì)乳酸菌是否形成生物胺進(jìn)行評(píng)價(jià)和檢測(cè)。

表3 部分乳酸菌產(chǎn)生物胺的PCR檢測(cè)和HPLC分析結(jié)果Table 3 PCR and HPLC results of biological amines produced by different lactic acid bacterial strains

3 結(jié) 論

本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保藏的60余株乳酸菌的氨基酸脫羧酶基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)其產(chǎn)生物胺的潛在可能性做初步分析，篩查出酪氨酸脫羧酶和組氨酸脫羧酶陽(yáng)性的菌株。利用HPLC法分析待測(cè)菌株在培養(yǎng)基體系和蔬菜發(fā)酵體系中產(chǎn)生物胺的情況，受試乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中產(chǎn)生組胺的含量在4.32～32.15mg/L之間。酪胺產(chǎn)生量在9.22～114.02mg/L之間。而在發(fā)酵蔬菜體系中，組胺和酪胺的產(chǎn)生量均小于40mg/L。結(jié)果低于美國(guó)FDA規(guī)定的食品中組胺含量低于50mg/L和酪胺含量高于100mg/L的限量標(biāo)準(zhǔn)要求。

[1]何慶華, 吳永寧, 印遇龍. 食品中生物胺研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2007, 19(5): 451-454.

[2]PARENTE E, MATUSCELLI M, GARDINI F, et al. Evolution ofmicrobial populations and biogenic amines production in dry sausages produced in southern Italy[J]. Journal of Applied Microbiology, 2001, 90: 882-891.

[3]NOUT M J R. Fermented foods and food safety[J]. Food Research International, 1994, 27: 291-298.

[4]劉辰麒, 丁卓平, 王錫昌. 生物胺的檢測(cè)方法評(píng)價(jià)[J]. 現(xiàn)代科學(xué)儀器, 2006(4): 89-91.

[5]SHALABY A R. Significance of biogenic amines to food safety and human health[J]. Food Research International, 1996, 29: 675-690.

[6]LONVAUD-FUNEL A, JOYEUX A. Histamine production by wine lactic acid bacteria: isolation of a histamine-producing strain of Leuconostoc oenos[J]. J Appl Bacteriol, 1994, 77: 401-407.

[7]IZQUIERDO-PULIDO M, CARCELLER-ROSA J M, VIDALCARON M C, et al. Tyramine formation by Pediococcus spp. during beer fermentation[J]. J Food Protect, 1997, 60: 831-836.

[8]MARCOBAL A, de LAS RIVAS B, MORENO-ARRIBAS M V, et al. Multiplex PCR method for the simultaneous detection of histamine-, tyramine-, and putrescine -producing lactic acid bacte-ria in foods[J]. J Food Protect, 2005, 68: 874-878.

[9]LANDETE J M, DE LAS RIVAS B, MARCOBAL A, et al. Molecular methods for the detection of biogenic amine-producing bacteria on foods [J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 117(3): 258-269.

[10]孟甜, 田豐偉, 陳衛(wèi), 等. 一種利用RT-HPLC分析乳酸菌產(chǎn)生物胺的方法[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2010, 37(1): 141-146.

[11]HWANG Dengfwu, CHANG Shenghsiung, SHIUA Chyuanyuan, et al. High-performance liquid chromatographic determination of biogenic amines in fish implicated in food poisoning[J]. Journal of Chromatography B, 1997, 693: 23-30.

[12]SILLA-SANTOS M H. Biogenic amines: their importance in foods[J]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 29: 213-231.

[13]程三寶, 朱俊玲, 馬儷珍. 微生物與發(fā)酵食品中的生物胺[J]. 食品工程, 2007(1): 11-13.

[14]蔡成崗, 張慧, 王智敏, 等. 食品中生物胺及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā), 2009, 30(10): 153-156.

[15]MARCOBAL A, MARTI-ALVAREZl P J, MORENO-ARRIBAS M V, et al. A multifactorial design for studying factors influencing growth and tyramine production of the lactic acid bacteria Lactobacillus brevis CECT 4669 and Enterococcus faecium BIFI-58[J]. Research in Microbiology, 2006, 157: 417-424.

[16]HALASZ A, BARATH A, SIMON-SARKADI L, et al. Biogenic-amines and their production by microorganisms in food[J]. Trends in Food Science and Technology, 1994, 5: 42-49.

Detection and Evaluation of Biological Amine Produced by Lactic Acid Bacteria for Vegetable Fermentation

TIAN Feng-wei，MENG Tian，DING Jun-rong，LIU Xiao-ming，ZHANG Hao，CHEN Wei*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

PCR and HPLC methods were used to detect and evaluate the capability of biological amine formation by more than 60 lactic acid bacterial strains. PCR detection of amino acid decarboxylase genes exhibited that 3 and 22 genes from tested strains were positive in histidine decarboxylase and tyrosine decarboxylase, respectively. At the same time, biological amine formation in tested strains was evaluated in MRS liquid media and vegetable fermentation model was determined by HPLC method. The production levels of histamine and tyramine produced by tested lactic acid bacteria in MRS media were 4.32-32.15 mg/L and 9.22-114.02 mg/L, respectively. In fermented cabbage system, production levels of both histamine and tyramine were less than 40 mg/L.

lactic acid bacteria；fermented vegetable； biological amine；histamine；tyramine；amino acid decarboxylase；detection

Q939.97

A

1002-6630(2010)24-0241-05

2010-04-23

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z353)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2009BAD9B05)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20836003)

田豐偉(1976—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：fwtian@jiangnan.edu.cn

*通信作者：陳衛(wèi)(1966—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：weichen@jiangnan.edu.cn