呂根法,王國治,石宏偉,王曉紅,鄭宏志,吳天順

內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide, LPS)是G-菌細(xì)胞外膜的重要組成部分, 它是引起全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)或膿毒癥(sepsis)等疾病的主要啟動(dòng)子[1]。內(nèi)毒素性疾病的防治研究是近 30多年來國際醫(yī)藥學(xué)界研究最為活躍的領(lǐng)域之一。其防治性措施有內(nèi)毒素中和蛋白、抗細(xì)胞因子及其受體的拮抗劑、應(yīng)用血管活性藥改善血液循環(huán)等[2], 廣泛涉及抗菌、抗毒素、多器官保護(hù)等, 但至今仍無有效的藥物供臨床使用。中醫(yī)藥在治療膿毒癥方面具有悠久歷史,研究表明中藥可通過直接破壞內(nèi)毒素、促進(jìn)內(nèi)毒素代謝、抑制巨噬細(xì)胞的活化等機(jī)制發(fā)揮對膿毒癥的治療作用[3], 如雙黃連、板藍(lán)根和清開靈、穿琥寧、魚腥草、大青葉等中藥在體外具有抑制內(nèi)毒素介導(dǎo)的鱟試劑反應(yīng);青蒿素、大黃素、丹參素等中藥有效成分亦具有拮抗內(nèi)毒素的作用。更令人關(guān)注的是赤芍、連翹、黃芩等單味中藥可破壞大腸桿菌內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu), 因此, 如果能夠從中草藥制備到與LPS作用的有效成分, 對開辟新的拮抗內(nèi)毒素藥物具有重要意義。本文就中草藥拮抗內(nèi)毒素及對膿毒癥的治療作用及作用機(jī)制的進(jìn)展作一綜述。

1 中和內(nèi)毒素素作用

與內(nèi)毒素結(jié)合后,通過抑制其活性或直接破壞內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu), 防止與機(jī)體效體細(xì)胞結(jié)合, 是治療膿毒癥的首要和關(guān)鍵措施。從中藥中分離提取具有抗內(nèi)毒素的單體化合物是實(shí)施中藥現(xiàn)代化的主要目標(biāo),但是目前發(fā)現(xiàn)的具有直接中和內(nèi)毒素作用的、來源于中藥提取物的單體化合物報(bào)道得相對較少, 而且部分化合物尚不能最終確定其化學(xué)結(jié)構(gòu),如桅子、地骨皮、白鮮皮等的提取物[4,5]。吳曉云等[6]將板藍(lán)根中分離出的31個(gè)化合物制成1 g/L溶液, 按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法作體外鱟試驗(yàn), 結(jié)果顯示3-(2' -羧基苯基)-4 -(3-H)喹唑酮、4-(3-H)-喹唑酮、丁香酸、鄰氨基苯甲酸、水楊酸和苯甲酸等6種單體化合物具直接的體外抗內(nèi)毒素作用。另外,研究顯示甘氨酸、黃芩苷、五沒食子酸葡萄糖[7]等在體外可以直接破壞內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)。

對內(nèi)毒素具有直接滅活作用研究最多的是單味中藥或中藥復(fù)方制劑,其中研究最多且較系統(tǒng)的是板藍(lán)根[8]。板藍(lán)根可直接破壞內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu),電鏡下顯示內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)由原有的鏈狀變成了短片狀或顆粒狀。基質(zhì)顯色法顯示, 板藍(lán)根注射液稀釋 2 500 倍仍能夠使內(nèi)毒素清除 70%以上。 劉云海[8]等比較了不同廠家生產(chǎn)的板藍(lán)根注射液抗內(nèi)毒素作用,發(fā)現(xiàn)其差別較大;并通過不同的提取方法對板藍(lán)根進(jìn)行分離提取,顯示其氯仿提取物內(nèi)含有較強(qiáng)的抗內(nèi)毒素活性成分,進(jìn)一步通過柱層析分離, 得到 4 個(gè)極性不同的成分F021、F022、F023和F024,分別用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法、熱原檢查法、對內(nèi)毒素致小鼠毒性保護(hù)力、對內(nèi)毒素致鼠巨噬細(xì)胞釋放炎性因子抑制作用及內(nèi)毒素定量檢測等方法, 比較 4種成分的抗內(nèi)毒素強(qiáng)度。結(jié)果顯示板藍(lán)根氯仿提取物中的F022抗內(nèi)毒素作用最強(qiáng),作者認(rèn)為, F022是板藍(lán)根抗內(nèi)毒素新藥研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。

對中藥拮抗內(nèi)毒素作用的研究主要是通過鱟試驗(yàn)來判斷的。但由于中藥的產(chǎn)地、提取方法以及實(shí)驗(yàn)方法的差異,結(jié)果亦有所不同。 對40 種中草藥的抗內(nèi)毒素作用進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)金銀花及其復(fù)方制劑能夠降低綠膿桿菌攻擊小鼠的死亡率;而其他的研究結(jié)果顯示烏梅、連翹、大黃、蛇床子有明顯拮抗內(nèi)毒素的功效。劉志峰[9]比較了 8種中藥注射劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙黃連粉針劑、清開靈注射液、板藍(lán)根注射液、穿琥寧注射液和魚腥草注射液都有明顯的體外抗內(nèi)毒素作用, 其中雙黃連、清開靈和板藍(lán)根的抗內(nèi)毒素作用最強(qiáng), 復(fù)方大青葉注射液和抗腮腺炎注射液的體外抗內(nèi)毒素作用較弱。目前報(bào)道的具有較強(qiáng)抗內(nèi)毒素作用的單味中藥有40多種, 如板藍(lán)根、紫花、金銀花、赤芍、連翹、黃芩等這些中藥主要屬于清熱解毒類,與中醫(yī)中藥治療膿毒癥的理論基礎(chǔ)相符。

許多復(fù)方制劑亦對內(nèi)毒素具有直接破壞作用, 這些復(fù)方制劑主要由清熱解毒類中藥組成。如熱毒平注射液、清解靈口服液、黃連解毒湯等可使內(nèi)毒素鏈狀結(jié)構(gòu)裂解成桿狀、片狀,甚至完全降解。

2 抑制炎性介質(zhì)釋放

內(nèi)毒素本身對機(jī)體損害并不嚴(yán)重, 其引起的SIRS或膿毒癥主要是通過活化巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等,釋放大量的TNF-α、IL-1α、IL-6 等炎癥介質(zhì)導(dǎo)致機(jī)體的病理損害甚至死亡。 TNF-α、IL-1α、IL-6的水平, 與預(yù)后呈正相關(guān), 實(shí)驗(yàn)證明動(dòng)物單獨(dú)注射TNF-α、IL-1α可出現(xiàn)幾乎所有的內(nèi)毒素的病理改變。因此, 對炎性介質(zhì)釋放的抑制或直接拮抗炎性介質(zhì)亦是治療膿毒癥的重要手段。 許多單味中藥及其復(fù)合制劑能夠顯著抑制由內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子釋放[10],通過對炎性細(xì)胞合成、分泌細(xì)胞因子的雙向調(diào)節(jié)作用、穩(wěn)定溶酶體、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、改善血液循環(huán)及免疫調(diào)節(jié)等作用, 抑制炎性細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子達(dá)到抗炎目的。

大黃、大黃素,丹參、丹參素在體外能夠抑制內(nèi)毒素刺激的巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、IL-8,且具有一定的量效關(guān)系, 同時(shí)大黃素和丹參素能激活單核吞噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子, 但所產(chǎn)生的量均顯著低于由內(nèi)毒素誘導(dǎo)所產(chǎn)生的量。 因此大黃素和丹參素可能具有雙向調(diào)節(jié)作用, 一方面能抗炎,另一方面強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。譚余慶[11]等通過實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為探討青蒿提取物通過降低脂質(zhì)過氧化物(LPO)、酸性磷酸酶(ACP)、內(nèi)毒素、 TNF-α濃度, 升高超氧化物歧化酶(SOD)活性等機(jī)制來發(fā)揮抗內(nèi)毒素作用;邱海波[12]等認(rèn)為雷公藤單體T4亦可呈劑量依賴性地抑制巨噬細(xì)胞釋放TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10、NO等。其他的報(bào)道[13]如桑色素能夠抑制內(nèi)毒素刺激動(dòng)物巨噬細(xì)胞NO、TNF-a、IL-12的釋放, 降低動(dòng)物死亡率;千層紙黃素能夠抑制內(nèi)毒素RAW 264.7巨噬細(xì)胞。 NF-kB的活性, 進(jìn)而抑制可誘導(dǎo)的一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶的基因表達(dá),減少NO生成;大黃素、大黃酸[14]顯著的抑制內(nèi)毒素刺激RAW 264.7 巨噬細(xì)胞NO、環(huán)氧化酶蛋白、PGE 2的生成等。

許多清熱解毒復(fù)方制劑亦具有明顯的抑制炎性介質(zhì)的作用。熱毒清(由金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草等中藥制成的靜脈注射液)能夠降低內(nèi)毒素攻擊家兔血漿TNF-α、IL-6,進(jìn)一步探討熱毒清抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)釋放的分子機(jī)制, 結(jié)果顯示熱毒清能有效地控制內(nèi)毒素刺激所引起的分泌型腫瘤壞死因子-α(sTNF-α)的高分泌, 雖然對TNF-α轉(zhuǎn)換酶m RNA(TACEmRNA)表達(dá)無明顯的抑制作用, 但對LPS刺激增加表達(dá)的TACEmRNA具有明顯的抑制效果。其他中藥復(fù)方制劑, 如中藥912 液、中藥合劑(丹參、大黃、白頭翁、敗醬草等)、厭氧靈(由黃連、黃芩、木通、大黃、甘草組成)等均顯示能夠抑制內(nèi)毒素刺激下巨噬細(xì)胞分泌腫瘤TNF-α、IL-1、IL-6的釋放,且具有一定的時(shí)效關(guān)系。

3 促進(jìn)內(nèi)毒素排出

腸道是人體最大的內(nèi)毒素庫, 機(jī)體在嚴(yán)重的創(chuàng)傷、感染等情況下, 可致腸黏膜屏障破壞, 引起腸源性感染和腸道內(nèi)毒素移位, 加重毒血癥。因此, 增強(qiáng)腸道屏障功能, 加快腸道內(nèi)毒素的排出是抗內(nèi)毒素的又一條途徑。中醫(yī)藥在這方面主要是使用通里攻下、清熱瀉下的中藥, 加速毒物排泄, 減少內(nèi)、外源性內(nèi)毒素吸收。這類中藥主要是由大黃成的復(fù)方制劑,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)大黃具有抑制多種致病菌、促進(jìn)腸蠕動(dòng)、增加腸系膜血流量等作用, 有利于清潔腸道。通過對大承氣湯及承氣合劑(大黃、枳實(shí)、厚樸、白頭翁、敗醬草)、瀉熱湯(大黃、芒硝、元參、甘草)的研究, 一方面能夠增強(qiáng)腸道蠕動(dòng),加速腸內(nèi)容物排出, 另一方面通過免疫調(diào)節(jié)作用, 增強(qiáng)肝臟內(nèi)毒素的廓清作用,而降低血漿內(nèi)毒素水平。次秀麗[15]等觀察到促動(dòng)合劑(以厚樸、大黃等為主藥組方)能夠降低TNF-α和內(nèi)毒素致休克模型大鼠腸黏膜通透性、細(xì)菌易位發(fā)生率及器官易位細(xì)菌數(shù)明顯減少, 降低血NO、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、二胺氧化酶(DAO)活性及小腸組織DAO活性。

4 改善微循環(huán)

內(nèi)毒素活化的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等釋放大量的炎性介質(zhì)、超氧陰離子等, 引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凝血功能紊亂等,造成微循環(huán)的障礙, 并最終導(dǎo)致多器官功能不全。中醫(yī)藥主要通過使用活血化淤、涼血化淤等藥物, 增加紅細(xì)胞膜抗損傷能力及流動(dòng)性,抑制血小板功能、抗凝、增加纖維蛋白溶解活性、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、降低血液高凝狀態(tài),如人參,丹參、赤芍、當(dāng)歸等。符為民等觀察地丹涼血注射液(水牛角、焦山梔、生地、丹皮、紫珠草、白茅根、丹參等)能夠改善內(nèi)毒素誘發(fā)DIC鼠的血流變化, 有效阻斷紅細(xì)胞過度凝集。復(fù)方丹參注射液能夠降低全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞剛性指數(shù)。唐朝克等[16]探討絞股藍(lán)總皂苷(GPS)對注射內(nèi)毒素的家兔血流動(dòng)力學(xué)和繼發(fā)DIC的影響,結(jié)果顯示絞股藍(lán)總皂苷能明顯改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo), 降低血小板數(shù)和纖維蛋白原量。趙興建觀察歸術(shù)破瘀湯對內(nèi)毒素性DIC大鼠的結(jié)果顯示:歸術(shù)破瘀湯能使血小板數(shù)量增加,出、凝血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間明顯縮短, 纖維蛋白原濃度顯著增加,且具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

5 免疫調(diào)節(jié)作用

中藥通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能, 促進(jìn)對內(nèi)毒素的吞噬廓清能力,一方面增強(qiáng)機(jī)體的抗毒功能, 另一方面促進(jìn)內(nèi)毒素的代謝。中醫(yī)藥主要通過益氣、扶正固本、生津養(yǎng)陰來實(shí)現(xiàn)這種作用。生脈注射液、參麥注射液等能夠激活單核-巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)吞噬功能。人參提取液[17]通過對機(jī)體反應(yīng)的影響,改變機(jī)體應(yīng)激狀態(tài), 提高機(jī)體對各種有害刺激的防御能力。黃芪[18]提取物能夠增加脾B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白, 誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的形成, 而且能夠一定程度增加TNF-a、IL-6分泌, 具有免疫調(diào)節(jié)活性。上述結(jié)果表明:增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞的功能,加速其體內(nèi)多種致病異物(包括內(nèi)毒素)的清除以保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的恒定, 可能是這類中藥的一個(gè)共性。

雖然近年來對中草藥拮抗內(nèi)毒素的作用進(jìn)行了大量的研究,但是這些研究大多數(shù)僅限于對中草藥整體的藥理作用研究,并不能明確其發(fā)揮內(nèi)毒素拮抗作用的物質(zhì)基礎(chǔ), 更不能從分子水平闡明其作用位點(diǎn), 因此制約了中草藥在內(nèi)毒素拮抗方面的深入研究及臨床使用。究其原因一方面可能由于單體成分的分離過程比較復(fù)雜繁瑣,傳統(tǒng)的中草藥在提取有效部位過程中, 是在臨床或藥理試驗(yàn)的配合下, 將中草藥用不同的溶劑進(jìn)行萃取, 以確定其有效部位, 然后再逐步劃分, 追蹤有效成分最集中的部位, 再通過多次柱層析, 或通過HPLC法, 最終將中草藥分出若干單體化合物,最后通過對每一單體的功能測試, 確定出所需的單體。這種方法雖然對一種中草藥中具有某種活性的成分能夠充分了解, 但操作復(fù)雜、繁瑣,不利于進(jìn)行大規(guī)模的研究。另一方面由于中草藥在研究拮抗內(nèi)毒素作用方面, 不能建立特異的篩選靶點(diǎn), 使得分離工作缺乏針對性;再者, 傳統(tǒng)的篩選是以鱟試驗(yàn)來判定某種成分是否具有中和內(nèi)毒素的作用,由于中草藥復(fù)雜的化學(xué)組成成分對鱟試劑的干擾,在結(jié)果的判斷上容易出現(xiàn)假陽性或假陰性[19]。因此,有必要建立特異性的篩選靶點(diǎn)和準(zhǔn)確的判定方法來加強(qiáng)單體抗內(nèi)毒素化合物的研究。 近年來[20]第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院綜合實(shí)驗(yàn)研究中心通過應(yīng)用生物傳感器技術(shù), 已經(jīng)成功地從中藥中分離到具有直接拮抗內(nèi)毒素的活性單體。為從中草藥抗內(nèi)毒素藥學(xué)作用物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了一條快捷的方法。

因此, 通過加強(qiáng)對中草藥抗內(nèi)毒素作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究, 不僅對臨床膿毒癥的防治具有理論意義, 而且為尋找新的抗內(nèi)毒素藥物研究開辟了新的研究領(lǐng)域。

[1] Crawford JH, Yang S, Zhou M, et al.Down-regulation of hepatic CYP1A2 plays an importan trole in inflammatory responses in sepsis[J].CritCareMed, 2004, 32(2):502-508.

[2] VallespiMG, Alvarez Obregon JC, Rodriguez-Alonso I, et al.A imulus anti-LPS factor-derived peptidemodulates cytokine gene expression and promotes resolution of bacterial acu te in fection inmice[J].Int Immunopharmacol, 2003, 3(2):247-256.

[3] 張藝平,韓鵬.中藥抗內(nèi)毒素研究新進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志, 2001, 8(2):122-124.

[4] 伏建峰,曹紅衛(wèi),龍宇鵬,等.地骨皮提取物CL-5拮抗內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)研究[J].創(chuàng)傷外科雜志, 2008, 10(3):260-263.

[5] 郭毅斌,曹紅衛(wèi),范莉,等.白鮮皮抗內(nèi)毒素活性物質(zhì)的分離提取[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 29(17):1654-1656.

[6] Wu XY, Liu YH, Sheng WY.et al.Chemical constituents of Isatis indigotical[J].Plalnta Medica, 1997, 63(4):55-57.

[7] Lv GF, Zhegn J, Zhou H, et al.The screening and isolation of an effective anti-endotoxin monomer from radix paeoniae rubra using biosensor techmology[J].International Immunopharmacol, 2005, 5:1007-1017.

[8] 劉云海, 秦國偉, 方建國,等.板藍(lán)根抗內(nèi)毒素活性化學(xué)成分的篩選[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2002, 21(2):74-75.

[9] 劉志峰,李桂生,傅風(fēng)華,等.8種中藥注射劑體外抗內(nèi)毒素作用的觀察[J].中草藥, 2002, 33(1):58-59.

[10] 邢杰,王淑芬, 翁福海.中藥抗炎作用與細(xì)胞因子[J].中草藥.2001, 32(5):471-472.

[11] 譚余慶,趙一, 林啟云,等.青蒿提取物抗內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中藥雜志, 1999, 24(3):166-168.

[12] 邱海波,陳德昌,潘家綺,等.雷公藤單體T4對小鼠肺泡巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 1999, 79(3):232-233.

[13] Wang CC, Huang YJ, Chen LG, et al Inducible nitric oxide synthase inhibitors of Chinese herbs III[J].Rheum palmatum PlantaMed, 2002, 68(10):869-874.

[14] Park EK, ChooMK, Yoon HK.Antithrombotic and antiallergic activities of rhaponticin from rheirhizoma are activated by human intestinal bacteria[J].Arch Pharm Res, 2002, 25(4):528-533.

[15] 次秀麗,王寶恩,張淑文, 等.腫瘤壞死因子和內(nèi)毒素致大鼠腸粘膜屏障損傷的中藥治療研究[J].中國危重急救醫(yī)學(xué), 1999, 11(5):263-265.

[16] 唐朝克,胡弼, 孫明,等.絞股藍(lán)總皂苷對注射內(nèi)毒素家兔血流動(dòng)力學(xué)和繼發(fā)DIC的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2000, 16(5):563-567.

[17] Smolinski AT, Pestka JJ.Modulation of lipopolysaccharide-induced proin flammatory cytokine production in vitro and in vivo by the herbal constituents ap igenin(chamomile), ginsenoside Rb(1)(ginseng)and parthenolide(feverfew)[J].Food Chem Toxicol, 2003, 41(10):1381-1390.

[18] Yoshida Y, Wang MQ, Liu JN, et al.Immunomodulating activity of Chinesemedicinal herbs and Olden landia diffusa in particular[J].Inter J Immuno, 1997, 19(7):359-370.

[19] 張靖賢.鱟試劑法測定細(xì)內(nèi)毒素影響因素的研究[J].醫(yī)學(xué)文選, 2002, 21(5):706-709.

[20] 呂根法,衛(wèi)國, 郭毅斌,等.生物傳感器技術(shù)在篩選赤芍中抗內(nèi)毒素有效單體成分的研究[J].中國藥房, 2005, 16(4):257-259.