王歡元綜述 匡?？祵徯?/p>

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，大約占腫瘤總的死亡人數(shù)的17%[1]。近年來盡管肺癌的診斷和治療取得一定的進(jìn)展，但其5年總體生存率仍低于15%[2]，所以預(yù)防和早期診斷是提高肺癌患者存活率的關(guān)鍵[3]。研究表明，腫瘤內(nèi)微血管計數(shù)的高低與肺癌的發(fā)生發(fā)展、組織類型及生存率有關(guān)。腫瘤內(nèi)微血管形成機(jī)制和抗血管生成治療肺癌成為研究熱點(diǎn)，現(xiàn)對腫瘤內(nèi)微血管的研究進(jìn)展綜述如下。

1 腫瘤內(nèi)微血管形成

1.1 腫瘤內(nèi)微血管形成定義

腫瘤內(nèi)微血管形成是指腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的微血管生長及腫瘤中血液循環(huán)建立的過程，其過程包括兩個階段：血管發(fā)生和血管生成。血管發(fā)生是指胚胎時期中胚層細(xì)胞分化形成內(nèi)細(xì)胞的前身即成血管細(xì)胞，從而構(gòu)成胚胎的原始血管系統(tǒng)。血管生成是指源于已存在的毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后微靜脈的新的毛細(xì)血管性血管的生長。腫瘤內(nèi)微血管形成過程主要步驟包括：① 血管內(nèi)皮及外膜細(xì)胞的激活；② 膜基質(zhì)的降解；③ 內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增生、分化；④ 新生毛血管的成熟器官化構(gòu)建。

1.2 腫瘤生長與血管關(guān)系

自從1971年Folkman博士首先提出了腫瘤生長依賴血管形成的概念，并提出抗腫瘤新生血管形成的技術(shù)可作為未來腫瘤治療的方向以來，許多學(xué)者經(jīng)過大量研究進(jìn)一步證實了新生血管形成與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。早期動物實驗發(fā)現(xiàn)，將腫瘤細(xì)胞團(tuán)混懸于眼前房中，因前房中無血管形成，所以腫瘤體積始終保持在1 mm3左右，可以維持很長一段時間，但腫瘤仍然保持存活；然而，一旦將這些腫瘤移植到虹膜后，新生血管迅速形成，腫瘤生長迅速，在2周內(nèi)可增加至原大小的1 600倍。而80年代后，人們通過血管抑制劑研究證實腫瘤生長依賴血管的生成，如Millauer等[4]使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將突變的位點(diǎn)缺陷VEGF受體FLK-1轉(zhuǎn)導(dǎo)至腦膠質(zhì)瘤中，結(jié)果腫瘤的血管形成受到抑制，腫瘤生長亦受到明顯抑制。

1.3 目前常用的檢測方法

腫瘤內(nèi)血管生長因子的檢測:目前測定血管生成因子反映腫瘤內(nèi)血管生成能力是腫瘤微血管研究的熱點(diǎn)。自從1989年Gospodarowicz等發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular ednothelial growth factor，VEGF)以來，許多學(xué)者就對它進(jìn)行了一系列的研究，認(rèn)為VEGF在血管新生中起重要作用[5]，VEGF的表達(dá)水平反映了腫瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管構(gòu)建水平。近年來許多學(xué)者通過PCR、ELISA、免疫組織化學(xué)SABC染色法、免疫組化(S-P)法等檢測VEGF在肺癌組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中VEGF陽性表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展、組織學(xué)類型、生存率具相關(guān)性，但VEGF是1個基因家族，包括PLGF，VEGFA、VEGFB，VEGFC、VFGFD及VEGFE，VEGF各因子與肺癌組織的其它相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

腫瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的檢測： 腫瘤內(nèi)血管的生成是腫瘤產(chǎn)生機(jī)理的重要環(huán)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞在新生血管發(fā)生中起關(guān)鍵作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的檢測也成為腫瘤微血管研究熱點(diǎn)。過去一些學(xué)者主要采用免疫組化技術(shù)檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子(如CD34、CD31)與腫瘤惡性程度及預(yù)后關(guān)系。近幾年來，許多學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulation endothelial cells，CEC)在正常人血中數(shù)量極少，而在炎癥、免疫應(yīng)答、感染、腫瘤形成和心血管疾病等情況下數(shù)量明顯增加。CEC的檢測方法目前主要有以下幾種：①Hladovec法：利用血液中各細(xì)胞成分的不同比重，用不同的離心力從血漿中分離出循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞。本方法在循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞研究的早期對提高CEC在臨床上的應(yīng)用起到了巨大的促進(jìn)和推動作用，但由于存在一些缺陷在科研、臨床中的運(yùn)用受到限制；②Percoll密度梯度快速一步分離法：應(yīng)用了密度梯度分層離心的原理，將適當(dāng)濃度的密度梯度分層液加入抗凝血中，利用血液中各種細(xì)胞的不同比重進(jìn)行離心分層。此法是現(xiàn)今科研臨床中使用較廣的分離CEC的方法；③免疫磁珠分離技術(shù)[6]：是通過采用包被著抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體的磁性顆粒來進(jìn)行的，由于存在對操作者要求高及試劑的大量消耗，在科研臨床中使用受到一定的限制；④流式細(xì)胞儀法：是在Percoll密度梯度離心法的基礎(chǔ)上，使用流式細(xì)胞儀對分離的細(xì)胞加以檢測、重選，并在此基礎(chǔ)上對CEC進(jìn)行檢測，但流式細(xì)胞儀的價格高，大多數(shù)實驗室都不具備，且操作復(fù)雜，限制了其臨床應(yīng)用。雖然CEC檢測方法眾多，但在外周血液中提取CEC仍存在一定問題，CEC計數(shù)技術(shù)有待進(jìn)一步提高。

腫瘤內(nèi)微血管密度法： 微血管密度法(microvessel density，MVD)是衡量腫瘤新生血管的重要方法，主要應(yīng)用特異性抗體標(biāo)記微血管，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)染色，在高倍顯微鏡下觀測微血管。但在高倍顯微鏡下微血管計數(shù)仍存在爭議，Weidner等最早認(rèn)為，在微血管密度最大區(qū)，取多個200倍視野的微血管記數(shù)的均數(shù)可作為微血管密度。隨著學(xué)者對癌組織的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在瘤組織中存在血管密集區(qū)，即“熱點(diǎn)”區(qū)，認(rèn)為該區(qū)血管密度值代表腫瘤血管生成能力，在該區(qū)取多個200倍視野的微血管記數(shù)的均數(shù)作為微血管密度。有學(xué)者[7]采用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究微血管密度，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)微血管的分布是不均勻的，單采用某熱區(qū)微血管密度并不能代表整個腫瘤內(nèi)微血管密度，存在明顯的誤差，而采用多個區(qū)域多個視野微血管密度取平均值可以縮小誤差，所以該技術(shù)有待進(jìn)一步完善。微血管密度法與肺癌的發(fā)生發(fā)展、組織類型、生存率的相關(guān)性已有文獻(xiàn)證實[8]，但微血管密度法與肺癌組織的其它相關(guān)性有待臨床研究。

影像學(xué)成像法： 影像學(xué)成像法作為1種無創(chuàng)的、方便的影像學(xué)技術(shù)，可以定量反映腫瘤微血管特征及與腫瘤血管生成相關(guān)的功能性變化，目前在臨床應(yīng)用較多的有CT，MRI。許多學(xué)者通過對CT動態(tài)增強(qiáng)和灌注成像的影像學(xué)參數(shù)與腫瘤血管生長的生理參數(shù)之間相關(guān)性研究，得出CT影像參數(shù)與大部分腫瘤的生理參數(shù)具有相關(guān)性[9]。而MRI更能反映血管的結(jié)構(gòu)、生理及功能的變化，已用于評價腫瘤的血管生成狀態(tài)，檢測腫瘤血供及血管生成的變化。新的靶向分子影像學(xué)出現(xiàn)，有助于探測調(diào)控血管生長、增殖的因素和途徑，為分子水平上研究腫瘤血管提供了新的途徑[10]。

1.4 與肺癌相關(guān)臨床研究

新生微血管是肺癌組織的生長和轉(zhuǎn)移所依賴的，大量的臨床研究通過各種檢測方法對腫瘤內(nèi)微血管的檢測證實，腫瘤內(nèi)微血管的形成與肺癌組織的生物特性具有一定的相關(guān)性。Akin等[11]通過ELISA法對非小細(xì)胞肺癌患者血清中的VEGF的水平檢測，發(fā)現(xiàn)血清中VEGF低水平(小于119 pg/ml)的生存率較高水平的(大于119 pg/ml)的生存率要高。Joo Hun Park等[12]通過ELISA法對早期肺癌患者的血清中血管生成素檢測，認(rèn)為血管生成素(Ang-1)可作為1種預(yù)測早期非小細(xì)胞肺癌患者的術(shù)后生存率和復(fù)發(fā)的潛在指標(biāo)。有學(xué)者采用特異性凝集素和CD146抗體檢測CEC水平，認(rèn)為在肺癌轉(zhuǎn)移患者中CEC水平高于無轉(zhuǎn)移者，可能是1種新的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)，CEC在肺癌組織中的應(yīng)用有待臨床進(jìn)一步研究。孫正濤等[13]采用免疫組織化學(xué)方法測定非小細(xì)胞肺癌組織中VEGF及MVD，發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)與MVD值呈正相關(guān)性，MVD值及VEGF表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

2 抗血管形成

2.1 抗血管形成機(jī)制

盡管到目前為止抗血管形成的作用機(jī)制并不很清楚，但大量研究表明人體存在1種血管新生的開關(guān)系統(tǒng)，即新血管生長刺激因子與抑制因子。當(dāng)抑制因子的力量超過刺激因子時，血管生長就停止，甚至萎縮。從理論上可以從以下幾個方面阻斷血管形成：①抑制蛋白降解酶的活性，防止內(nèi)皮細(xì)胞活化；②干擾血管生長因子的合成、釋放及生物效應(yīng)的發(fā)生；③阻止內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；④阻止內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

2.2 目前抗血管形成的研究

2.2.1 血管生成抑制因子研究 血管生成抑制因子是干擾新生血管形成的各個階段的一系列因子，目前研究主要集中在內(nèi)源性血管生成抑制因子，主要包括血管抑素、內(nèi)皮抑素、肌鈣蛋白-1、色素上皮衍生因子(PEDF)、血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)、煙曲霉素等，及其它相關(guān)的一些因子如血小板第四因子、趨化因子gro-β、干擾素-α，γ，白介素-12，18等。血管抑素和內(nèi)皮抑素是目前研究較多的抑制因子。血管抑素是從腫瘤耐受性動物模型的血清和尿液中分離出來的與腫瘤生長相關(guān)的第1種內(nèi)源性血管生成抑制因子；內(nèi)皮抑素也是用類似方法從腫瘤耐受動物體液中分離出的抑制因子，兩者均能強(qiáng)烈、特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制新生血管形成，其抗血管生長作用強(qiáng)于其它血管生長抑制因子。血管生成抑制因子的研究成為近年來的熱點(diǎn)，尋找作用較強(qiáng)的血管生長抑制因子是該領(lǐng)域的關(guān)鍵，目前有幾種抑制因子進(jìn)入了早期臨床實驗，可能為治療腫瘤提供新的途徑。

2.2.2 蛋白酶抑制劑研究 蛋白酶解的作用在新生血管的形成過程中起著重要的作用，如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解基膜，促使內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入基膜，參與新生血管的形成。而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑能阻斷這一過程，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲及新生血管的產(chǎn)生。研究證實幾乎所有的MMPs抑制因子如TIMP-1，2，3都能抑制血管新生。目前，至少有6種人工合成MMP抑制劑(如BB94，BB2516，KB-R7785等)進(jìn)入腫瘤治療的臨床試驗。

2.2.3 基因治療的研究 重復(fù)注射重組血管生成抑制因子能有效阻止腫瘤的血管化，并抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，但存在一定的缺點(diǎn)：①價格較貴、不方便；②代謝快；③反復(fù)注射可能帶來病毒感染。目前用于抗腫瘤血管生成基因治療肺癌已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)，研究較多的主要有以下幾種：① 內(nèi)皮抑素基因； ②血管抑素基因；③血管內(nèi)皮生長因子及其受體基因；④白介素-12及白介素-8基因；⑤野生型p53基因等。雖然近年來的研究表明，某些基因治療肺癌的效果已得到臨床研究的證實，但作用機(jī)制至今未研究透徹。

2.2.4 藥物抑制劑的研究 從90年代人們發(fā)現(xiàn)1種具有較強(qiáng)的抗血管生成活性的半合成的煙曲霉素類似物開始，眾多學(xué)者致力于研究藥物抑制劑治療腫瘤的效果。雖然一些藥物抑制劑治療腫瘤已在臨床上證實具有一定的療效，如博來霉素，蘇拉明，及以血管內(nèi)皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子受體為靶點(diǎn)進(jìn)行的抗血管生長治療藥物中腺病毒介導(dǎo)的p53基因及Bevacizumab等，但尋找高效、低毒、廉價、易得的藥物抑制劑仍是該領(lǐng)域的關(guān)鍵問題。

2.3 抗血管生成與肺癌治療的研究

肺腫瘤血管生成是1個受眾多生長因子(包括血管生成因子、血管生成抑制因子、生長因子和凋亡因子等)調(diào)節(jié)的復(fù)雜的病理生理過程，而抗血管生成的機(jī)制主要抑制促血管生成因子與配體的表達(dá)和結(jié)合及相應(yīng)的信號傳遞途徑的過程。由于肺腫瘤細(xì)胞常因染色體變異造成基因組不穩(wěn)定，致使常規(guī)化療易產(chǎn)生耐藥性；而血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)相對穩(wěn)定，突變率低，很少或不產(chǎn)生對化療的耐藥性等特點(diǎn)，加之成熟組織幾乎沒有新生血管生成，使抗腫瘤血管生成成為近年來的肺腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。單克隆抗體貝伐單抗(Bevacizumab)是抗VEGF的重組人源化單克隆抗體，是第1個被批準(zhǔn)用于抑制血管生長的單克隆抗體藥物。于2004年3月份在美國上市后，Bevacizumab在NSCLCⅢ期臨床試驗中顯示了較好的療效[14]，Dansin等[15]認(rèn)為Bevacizumab聯(lián)合化療用于晚期NSCLC的一線治療有一定價值。Bevacizumab在治療肺腫瘤臨床應(yīng)用中觀察到了治療后的咯血，且伴有腫瘤壞死、空洞形成。有研究表明[16]腫瘤內(nèi)的空洞可能為抗血管生成治療有效的1種特殊征象，繼續(xù)治療后腫瘤明顯縮小。近年來1種新的抗腫瘤新生血管的藥物—重組人血管內(nèi)皮抑制素(YH-16)已進(jìn)入臨床試驗。有學(xué)者報道其作用可能是對部分生長因子如堿性成纖維生長因子(Bfgf/FGF-2)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的促血管生成作用進(jìn)行了干預(yù)。穆海玉等[17]臨床觀察重組人血管內(nèi)皮抑素(YH-16)聯(lián)合化療靶向治療晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床療效、毒性反應(yīng)，把62例晚期非小細(xì)胞肺癌患者隨機(jī)分為2組，臨床研究表明血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療藥物對晚期非小細(xì)胞肺癌具有較好的療效，尤其在改善患者生存質(zhì)量方面具有優(yōu)勢。黃純等[18]臨床試驗認(rèn)為，接種高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞的小鼠經(jīng)YH-16作用后，其原接種處移植瘤及肺轉(zhuǎn)移灶之瘤塊組織中的VEGF和微血管密度均明顯降低、局部瘤體縮小、肺轉(zhuǎn)移發(fā)生亦同時降低。同期臨床研究亦表明[19]，YH-16聯(lián)合NP方案治療ⅢB或Ⅳ期NSCLC患者，提示YH-16聯(lián)合NP治療有可能使含鉑一線甚至多線化療失敗者繼續(xù)臨床受益。

綜上所述，肺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用而成的，但其生長、浸潤、轉(zhuǎn)移離不開新生微血管。近幾年來相關(guān)研究表明，腫瘤內(nèi)微血管形成與肺癌組織的生物特性具有相關(guān)性，但如何參與肺癌組織的發(fā)生發(fā)展，以及在肺癌組織類型中存在哪些差異，如何提高肺癌組織中的微血管形成的檢測水平等問題有待進(jìn)一步研究。盡管近年來抗血管生成抑制劑在實驗研究及臨床適用階段取得一定的效果，雖然很難確切評價其臨床應(yīng)用價值，但為臨床治療肺癌提供了新的途徑。當(dāng)然存在不少問題有待進(jìn)一步解決，如腫瘤血管生成機(jī)制如何，對人類肺癌的療效與實驗性Lewis 肺癌的療效是否相似，長期應(yīng)用血管生成抑制劑的毒副作用，如何確定血管生成抑制劑的最佳給藥時間、劑量以及聯(lián)合化療的方案等。積極而慎重地探討研究與肺癌組織的生物特性有關(guān)的因素，提高肺癌的早期診斷率及生存率對于治療肺癌仍具要重要意義和臨床應(yīng)用價值。

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