李 化 王春生 陳志強(qiáng) 丁文軍 趙 東 洪 濤 陳 昊

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心外科,上海市心血管病研究所,上海 200032)

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組擁有超過20種降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的含2價鋅離子的水解酶,各種MMPs之間有相互交叉的底物,但每種MMP至少能降解1種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白。在血管壁中,MMPs由各種細(xì)胞合成并分泌或表達(dá)在細(xì)胞膜表面,有促ECM新陳代謝和血管壁重構(gòu)的作用。MMPs的轉(zhuǎn)錄、合成和活性在冠脈粥樣硬化斑塊的纖維帽中明顯上調(diào),促進(jìn)斑塊破裂[1]。MMPs的表達(dá)異常能造成血管壁的結(jié)構(gòu)改變[2-3]。

由于正常人冠狀動脈存在的一定程度的內(nèi)膜增厚[4]構(gòu)成了各種病理性冠脈內(nèi)膜增厚的基礎(chǔ),而冠狀動脈內(nèi)膜增厚所致管腔狹窄是許多心臟疾病的基礎(chǔ)病理學(xué)改變。我們猜想MMPs降解ECM的作用異?？赡軙?dǎo)致冠脈內(nèi)膜的增厚。以往關(guān)于MMPs在冠脈中的作用研究多局限于動物實(shí)驗(yàn)[2,5-6]或人體頸動脈或冠狀動脈內(nèi)膜切除術(shù)中取出的部分內(nèi)膜組織[1,3]。本研究利用擴(kuò)張性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)心臟移植術(shù)中獲取的完整冠狀動脈組織,用Western blot半定量法檢測MMPs蛋白在冠脈壁中的表達(dá),探討MMPs與冠脈內(nèi)膜增厚的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在2004年10月—2007年5月行心臟移植術(shù)的患者中選擇20例無心肌缺血的臨床表現(xiàn)、病理檢查顯示冠脈無粥樣硬化病變的DCM患者。提取術(shù)中取出的受體心臟的左前降支冠狀動脈,取一小段用10%福爾馬林固定,將余下冠脈的外膜仔細(xì)從中層分離,使所取的冠脈中層和內(nèi)膜層組織量達(dá)到0.3 g。

1.2 MMPs的檢測 用Western blot半定量法檢測冠狀動脈壁內(nèi)MMPs的蛋白表達(dá)。將冠脈的中層和內(nèi)膜組織作成勻漿,加RIPA裂解液,復(fù)合蛋白酶抑制劑(Roche公司),13 000 g離心30 min,取上清液。用Lowry法(Pierce Biotech公司)測蛋白濃度,還原型上樣緩沖液,10%SDS膠,每孔上樣量50 μg。硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜。第 1抗體:小鼠抗人MMP-1、2、3、9、13、14單克隆抗體(EMD Chemicals公司),4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶(H RP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(KPL公司)作為第2抗體25℃孵育1 h。底物為ECL發(fā)光試劑(Pierce公司),用小鼠IgG(Abcam公司)代替一抗作為陰性對照。小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(Santa Cruz公司)作為內(nèi)參。掃描顯影后的條帶,用軟件ImageJ 1.37V計(jì)算每條條帶的總象素值。以每個標(biāo)本目標(biāo)條帶與相應(yīng)的GAPDH條帶的總象素值比值作為該蛋白的檢測結(jié)果。

1.3 組織形態(tài)觀察 將10%甲醛固定的冠狀動脈用石蠟包埋,5μm間隔連續(xù)切片備用。行HE、彈性纖維 van Gieson染色(EVG)、Masson三色法(MT)染色,物鏡(40×)下觀察組織形態(tài)學(xué)變化,并拍照。應(yīng)用軟件ImageJ 1.37V計(jì)算中層和內(nèi)膜層的面積,考慮到冠脈直徑大小的取樣誤差,用內(nèi)膜與中層面積比來定量內(nèi)膜增厚的程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 連續(xù)變量用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。Pearson直線相關(guān)分析2個變量的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)用r表示。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 11和Sigmaplot 8.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 20例DCM 患者年齡12～72歲,平均(42.9±16.6)歲;男性 14例,女性6例。3例(15%)患高血壓,6例(30%)患糖尿病,4例(20%)患高脂血癥。術(shù)前左心室射血分?jǐn)?shù)10%～30%,平均(19.35±5.85)%。

2.2 組織形態(tài)學(xué) 結(jié)合HE、EVG、MT染色,發(fā)現(xiàn)20例DCM患者的冠狀動脈均有不同程度同心圓形的內(nèi)膜增厚(圖1),內(nèi)膜與中層面積比平均為0.83±0.33。內(nèi)彈力纖維層較完整,偶有斷裂;增厚的內(nèi)膜為細(xì)胞纖維性,有時內(nèi)膜內(nèi)可見多層的節(jié)段狀彈力纖維,少見纖維脂肪樣細(xì)胞分布。

圖1 DCM冠脈切片的HE和MT染色(×400)

2.3 MMPs表達(dá)與內(nèi)膜增厚的相關(guān)性 Western blot半定量分析(圖2)顯示冠脈壁中的MMP-3蛋白(r=-0.62,P＜0.005)及 MMP-9蛋白(r=-0.47,P＜0.05)的表達(dá)和冠脈內(nèi)膜與中層面積比呈負(fù)相關(guān)。冠脈內(nèi)膜增厚的程度和MMP-1蛋白(r=0.207,P=0.387)、MMP-2蛋白(r=0.159,P=0.504)、MMP-13蛋白(r=-0.293,P=0.211)、MMP-14蛋白(r=-0.104,P=0.662)及年齡(r=0.281,P=0.23)無顯著相關(guān)性。

圖2 Western blot顯示 MMP-1、2、3、9、13、14 蛋白條帶

3 討 論

鑒于心臟冠狀動脈內(nèi)膜增厚所致管腔狹窄是許多心臟疾病(如冠狀動脈粥樣硬化、冠脈成形術(shù)后再狹窄、移植心臟血管病變等)的基礎(chǔ)病理學(xué)改變,所以研究冠脈內(nèi)膜增厚的機(jī)制顯得十分重要。以往研究[4]表明正常人存在一定程度的冠脈內(nèi)膜增厚,這是各種病理性內(nèi)膜增厚的基礎(chǔ)。我們希望通過研究冠脈無粥樣硬化病變的DCM患者的內(nèi)膜增厚機(jī)制為冠脈疾病發(fā)生機(jī)制的研究提供一定理論基礎(chǔ)。

ECM組成了細(xì)胞外復(fù)雜的支架系統(tǒng),起著支撐細(xì)胞和組成細(xì)胞外微環(huán)境的作用,ECM合成的增加是冠脈壁增厚的重要機(jī)制之一。由于MMPs能降解組成ECM的各種蛋白成分,因此在各種冠脈疾病的發(fā)生機(jī)制中起著重要的作用。MMPs家族可分為 :(1)膠原酶 ,包括 MMP-1、8、13,裂解 I、II 和III型膠原的三倍體螺旋結(jié)構(gòu);(2)明膠酶,包括MMP-2、9,降解彈性蛋白和經(jīng)膠原酶裂解后的膠原單體;(3)基質(zhì)裂解素,包括MMP-3、10、11,降解蛋白聚糖、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白和膠原單體,其中MMP-3作用最強(qiáng);(4)表達(dá)在細(xì)胞膜上的膜型MMPs,包括MT-MMP1(MMP-14)、2、3、4,降解明膠、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、波連蛋白和硫酸皮膚素蛋白多糖。另外還有基質(zhì)溶解因子MMP-7、金屬彈性蛋白酶MMP-12。本研究選擇 MMP-1、2、3、9、13、14蛋白作為研究對象,分屬于4種MMPs,基本上能涵蓋MMPs在冠脈壁中的作用譜。

以往研究[2,6]表明消除MMPs基因的作用能促進(jìn)病變動脈內(nèi)膜的增厚。在敲除MMP-3基因的小鼠主動脈粥樣斑塊模型中,動脈粥樣內(nèi)膜增厚的程度以及動脈內(nèi)膜內(nèi)纖維化程度較未敲除基因的對照組明顯增加[6]。同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在敲除MMP-3和MMP-9基因的小鼠頭臂干動脈粥樣斑塊模型中[2]。在敲除組織MMPs抑制物-1(TIMP-1)基因后,MMPs的活性增強(qiáng),可導(dǎo)致小鼠粥樣斑塊明顯縮小并且出現(xiàn)動脈瘤樣擴(kuò)張[5]。通過對人體冠脈內(nèi)膜切除術(shù)中取出的內(nèi)膜組織的免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)MMP-3高表達(dá)的冠脈的擴(kuò)張程度較高,說明MMP-3通過降解冠脈壁的ECM造成冠脈直徑的擴(kuò)大[3]。以上報道均說明MMP-3和 MMP-9對ECM的降解在冠脈壁重構(gòu)中的重要作用。

血管平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell,SMC)在內(nèi)膜層內(nèi)的遷移、增生所引起冠脈內(nèi)膜增厚已被公認(rèn)為是諸多心血管疾病(如冠狀動脈粥樣硬化)的基本病理改變。我們通過免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)在DCM增厚的內(nèi)膜層內(nèi)存在SMC廣泛增生(待發(fā)表中)。以往的研究發(fā)現(xiàn),在通過基因轉(zhuǎn)染組織MMP抑制物(TIMPs)的人大隱靜脈中,MMPs作用受到抑制,而向內(nèi)膜遷移的SMC明顯減少并導(dǎo)致內(nèi)膜增厚的程度減低[7];敲除 TIMP-1基因的小鼠MMP-2的活性增高,使損傷后的股動脈內(nèi)膜的增厚程度和SMC的增生均高于對照組[8]。這種機(jī)制被認(rèn)為是MMPs降解構(gòu)成內(nèi)膜基底膜的IV型膠原、層粘連蛋白和硫酸皮膚素蛋白多糖,從而促使SMC穿過基底膜由中層向內(nèi)膜層遷移。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-1、2、13、14的表達(dá)高低與內(nèi)膜增厚無關(guān)聯(lián),可能是由于MMPs有促SMC遷移至內(nèi)膜層使得內(nèi)膜層增厚和降解內(nèi)膜ECM兩方面的作用,最終綜合起來不會影響到冠脈內(nèi)膜的增厚程度。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)MMP-3和MMP-9的表達(dá)與冠脈內(nèi)膜增厚程度呈負(fù)相關(guān),說明在MMPs表達(dá)差異引起冠脈內(nèi)膜增厚的機(jī)制中,MMP-3和MMP-9的下調(diào)起著重要的作用。

1 Jason LJ,Christopher LJ,Gianni DA,et al.Activation of matrix-degrading metalloproteinasesby mast cell proteases in atherosclerotic plaques[J].A rterioscler Thromb Vasc Biol,1998,18(11):1707-1715.

2 Jason LJ,Sarah JG,Andrew CN,et al.Divergent effects of matrix metalloproteinases 3,7,9,and 12 on atherosclerotic plaque stability in mouse brachiocephalic arteries[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:15575-15580.

3 Paul S,Geoffrey V,Khaled MZ,et al.Relation of matrix-metalloproteinase 3 found in coronary lesion samples retrieved by directional coronary atherectomy to intravascular ultrasound observations on coronary remodeling[J].Am J Cardiol,2002,89:1354-1359.

4 Stary HC.Macrophages,macrophage foam cells,and eccentric intimal thickening in the coronary arteries of young children[J].Atherosclerosis,1987,64:91-108.

5 Silence J,Collen D,Lijnen HR.Reduced atherosclerotic plaque but enhanced aneurysm formation in mice with inactivation of the tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1)gene[J].Circ Res,2002,90(8):897-903.

6 Silence J,Lupu F,Collen D,et al.Persistence of atherosclerotic plaque but reduced aneury sm formation in mice with stromelysin-1(M MP-3)gene inactivation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21:1440-1445.

7 Concepcion MA,Sarah JG,Jason LJ,et al.Relationship between type IV collagen degradation,metalloproteinase activity and smooth muscle cell migration and proliferation in cultured human saphenous vein[J].Cardiovasc Res,2003,58:679-688.

8 Lijnen HR,Soloway P,Collen D.Tissueinhibitor of matrix metalloproteinases-1impairs arterial neointima formation after vascular injury in mice[J].Circ Res,2002,91:1186-1191.