朱建波 趙銘山

(1.山東省濱州市人民醫(yī)院,山東濱州 256603;2.濱州醫(yī)學(xué)院,山東濱州 256603)

支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞,包括嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil,EOS)、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞及其細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥,其中EOS起著尤為關(guān)鍵的作用[1-2]。骨髓釋放EOS向肺組織內(nèi)趨化、黏附及EOS凋亡障礙是哮喘EOS增多的主要機(jī)制。聚集活化的EOS不但可以分泌多種炎性物質(zhì)破壞氣道黏膜,影響肺臟正常的生理功能,而且活化的EOS能夠合成、分泌轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2),參與氣道重塑;通過表達(dá)過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR gamma)抑制氣道的免疫反應(yīng)[3]。

長效 β2受體激動劑(long-actingβ2-agonist,LABA)因其起效快、作用時間長而倍受臨床醫(yī)師青睞。沙美特羅和福莫特羅(formoterol,FMT)是LABA的代表藥物,然而近年來有報道[4]β2受體激動劑在體外能夠抑制EOS凋亡,可能加重氣道炎癥。而糖皮質(zhì)激素能夠抑制EOS向肺內(nèi)遷移,快速誘導(dǎo)外周血中EOS及組織中EOS凋亡;能夠減少肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞趨化活化因子(eotaxin)的表達(dá),抑制包括嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)在內(nèi)的多種炎性介質(zhì)的釋放,已被證實(shí)為抑制哮喘氣道EOS炎癥方面最有效的藥物。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制哮喘大鼠模型,以地塞米松為對照,研究福莫特羅在體內(nèi)對EOS浸潤氣道的作用,為臨床治療哮喘提供參考。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Wistar大鼠(SPF級,購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)儀器 富馬酸福莫特羅(沈陽山之內(nèi)制藥有限公司生產(chǎn));地塞米松磷酸鈉注射液(濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn));卵蛋白(Ⅲ級)(Sigma公司提供,編號A5378);大鼠 eotaxin酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn));大鼠ECP酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海軒昊科技有限公司生產(chǎn));原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL)、DAB顯色試劑(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 哮喘模型的制備及給藥方法 48只雄性Wistar大鼠,鼠齡 6～ 8周,體質(zhì)量 180～220 g,隨機(jī)分為6組,每組8只。A組為正常對照組;B組為哮喘模型組;C組為小劑量福莫特羅組(0.08 mg?kg-1);D中等劑量福莫特羅組(0.12 mg?kg-1);E組為大劑量福莫特羅組(0.16 mg?kg-1);F組為地塞米松組(0.5 mg?kg-1)。模型復(fù)制參照文獻(xiàn)[5]并加以改進(jìn),正常對照組給予等量的0.9%氯化鈉液(NS)對照操作。各實(shí)驗(yàn)組第1、8天注射卵蛋白(albumin,OVA)混懸液(OVA 1 mg,0.9%氯化鈉液1 mL,氫氧化鋁 200 mg,四肢內(nèi)側(cè)皮下、腹腔內(nèi)各注射0.2 mL)。第15天起將大鼠放入自制密閉容器內(nèi),2%卵蛋白混懸液霧化吸入30 min,大鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、點(diǎn)頭呼吸、打噴嚏、煩躁不安、大小便失禁等過敏反應(yīng)癥狀。對照組給予0.9%氯化鈉液霧化吸入相同時間。按照以上方法每天霧化吸入1次,連用10 d。

給藥方法:從第18天(即第4次誘發(fā)哮喘日)開始,每次誘發(fā)前1 h,激素組給予地塞米松腹腔注射,0.9%氯化鈉液灌胃;福莫特羅組給予相應(yīng)劑量的0.9%氯化鈉液腹腔注射,福莫特羅灌胃;對照組分別給予0.9%氯化鈉液腹腔注射,0.9%氯化鈉液灌胃。連用7 d。

1.3.2 取材及標(biāo)本制備 最后1次誘發(fā)哮喘后48 h(中性粒細(xì)胞＜1%,淋巴細(xì)胞＜9%),2%戊巴比妥鈉(46 mg?kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,將其仰面固定在解剖臺上,打開腹腔,從腹主動脈抽血5～10 mL,剪斷腹主動脈。打開胸腔,剪開左心耳,充分放血。切取右肺,稱體質(zhì)量后-80℃凍存。左肺切成厚度約4 mm組織塊,4%多聚甲醛固定。切取右側(cè)肺組織,稱質(zhì)量后-80℃冰凍30 min。30 min后將冰凍肺組織放入勻漿器內(nèi),加入少量冰0.9%氯化鈉液(0.5 mL?g-1,以 20 000 r?min-1離心 10 min將組織攪碎。勻漿液以3 000 r?min-1離心10 min,留取上清液-80℃凍存?zhèn)溆?。切取左?cè)肺組織,4%多聚甲醛內(nèi)固定4～5 h,經(jīng)過水洗、梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋。采用連續(xù)切片的方法行HE染色及原位凋亡測定,觀察組織炎癥變化、EOS浸潤及凋亡情況。

1.3.3 嗜酸性粒細(xì)胞趨化活化因子(eotaxin)及ECP測定 用酶聯(lián)免疫吸附的方法測定(按照說明書操作)。

1.3.4 EOS凋亡率的測定 用原位凋亡的方法(TUNEL)測定肺組織切片中凋亡的 EOS(按照說明書操作)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(ˉx±s)表示。各組數(shù)據(jù)均行正態(tài)檢驗(yàn)(Q-Q圖)和方差齊性檢驗(yàn)(Levene法)。各指標(biāo)比較均采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn);指標(biāo)間相關(guān)比較采用Pearson相關(guān)分析;P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理改變 HE染色的EOS在鏡下表現(xiàn)為胞漿呈鮮紅色,細(xì)胞核為桿狀或呈分葉狀。正常大鼠肺組織中EOS數(shù)量少,哮喘組肺組織內(nèi)有大量EOS浸潤,福莫特羅組浸潤EOS數(shù)量明顯減少,并且隨福莫特羅劑量增加,EOS數(shù)量遞減。糖皮質(zhì)激素組多種炎癥細(xì)胞減少(圖1)。

2.2 各組大鼠肺組織切片EOS原位凋亡(圖2);各組大鼠肺組織中浸潤EOS數(shù)量及其凋亡指數(shù)(表

1) 蘇木素復(fù)染后的組織切片中凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核為棕黃色。每張切片由同一名觀察者在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇10個視野,分別計算支氣管、血管周圍EOS浸潤的數(shù)量及凋亡指數(shù)(凋亡細(xì)胞占相應(yīng)EOS的百分比),平均值作為該片的代表值。哮喘模型組可見大量未凋亡的EOS,凋亡明顯延遲,凋亡指數(shù)下降;福莫特羅組EOS凋亡抑制,凋亡指數(shù)降低;地塞米松組EOS凋亡延遲幾乎能夠完全糾正,凋亡指數(shù)提高。

圖1 各組大鼠肺組織病理改變(HE染色×400)

圖2 各組大鼠肺組織原位凋亡圖(蘇木素復(fù)染×400)

A.正常對照組 氣管周圍浸潤炎癥細(xì)胞較少,但凋亡細(xì)胞較多,其中可見分葉核的EOS,亦可見凋亡的上皮細(xì)胞,淋巴細(xì)胞。B.哮喘模型組氣管周圍可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤,主要為EOS和淋巴細(xì)胞。凋亡的EOS為分葉或桿狀核,而凋亡的淋巴細(xì)胞核多為圓形,胞核均黃染。C.小劑量福莫特羅組 氣管周圍浸潤EOS較哮喘模型組減少,凋亡細(xì)胞比例也有所減少。D.中等劑量福莫特羅組氣管周圍浸潤EOS較小劑量福莫特羅組減少,凋亡細(xì)胞的比例也降低。E.大劑量福莫特羅組氣管周圍浸潤EOS減少,凋亡細(xì)胞的比例進(jìn)一步下降。F.地塞米松組氣管周圍浸潤炎癥細(xì)胞較少,但是凋亡細(xì)胞較多,可見凋亡的EOS和淋巴細(xì)胞。

2.3 各組大鼠肺組織勻漿中eotaxin及ECP的含量(表2),福莫特羅干預(yù)下浸潤EOS數(shù)量與eotaxin直線相關(guān)分析 哮喘大鼠肺組織中eotaxin及ECP的含量明顯增加,而福莫特羅各組含量明顯減少;肺組織中EOS浸潤數(shù)量與eotaxin的含量呈直線正相關(guān)(圖3)。

表1 各組大鼠肺組織中浸潤EOS數(shù)量及其凋亡指數(shù)(ˉx±s)

表2 各組大鼠肺組織勻漿中eotaxin及ECP的含量(ˉx±s)

圖3 福莫特羅干預(yù)下EOS數(shù)量與eotaxin含量相關(guān)分析

3 討 論

哮喘的本質(zhì)是氣道炎癥,多種炎癥細(xì)胞長期浸潤氣道是支氣管哮喘的一個突出特征。對基因缺失(如表達(dá)IL-5,IL-4的基因)大鼠模型的研究[6]表明了EOS在哮喘病理改變和氣道高反應(yīng)性中的重要作用。無論是哮喘的急性發(fā)作期還是緩解期,氣道內(nèi)都有大量的EOS浸潤,對氣道造成持續(xù)性破壞,這被認(rèn)為是哮喘經(jīng)久不愈,慢性遷延的原因之一,而減少肺內(nèi)EOS的浸潤則促進(jìn)哮喘氣道炎癥的消退。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示福莫特羅組大鼠肺組織內(nèi)EOS凋亡指數(shù)下降,說明福莫特羅在體內(nèi)能夠抑制EOS凋亡,但福莫特羅抑制EOS凋亡的作用無明顯的劑量依賴性。Machida等[4]在體外發(fā)現(xiàn)福莫特羅抑制EOS凋亡的作用隨濃度增高范圍內(nèi)逐漸增強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚需增加福莫特羅劑量差距,觀察其抑制作用是否具有劑量依賴性。

除了EOS凋亡障礙,骨髓釋放的EOS向肺組織內(nèi)趨化、黏附也是影響哮喘EOS增多的機(jī)制,為此我們做了相應(yīng)的研究。影響EOS向肺組織內(nèi)遷移的主要細(xì)胞因子是IL-5和eotaxin,有研究[7]表明福莫特羅不能通過IL-5影響EOS在肺組織內(nèi)的浸潤,而可能通過影響eotaxin的表達(dá)來影響EOS的浸潤。eotaxin是由呼吸道上皮細(xì)胞、平滑肌、纖維母細(xì)胞及多種炎癥細(xì)胞,如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和EOS等分泌的,屬于C-C化學(xué)性趨化因子超家族中的β亞群。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)福莫特羅能減少肺組織勻漿中eotaxin的含量,且福莫特羅干預(yù)后氣道中浸潤的EOS數(shù)量與肺組織勻漿中eotaxin呈直線正相關(guān),說明福莫特羅可能通過抑制eotaxin的表達(dá)減少肺組織內(nèi)浸潤的EOS數(shù)量。體外實(shí)驗(yàn)有研究表明福莫特羅能夠通過抑制平滑肌細(xì)胞組蛋白H4乙酰化從而抑制eotaxin基因轉(zhuǎn)錄減少其表達(dá)。

活化的EOS能夠分泌多種毒性蛋白,痰液中的ECP較血清中的含量更能反映患者病情的嚴(yán)重程度,是抗炎療效的觀測指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)測定了肺組織勻漿中ECP的含量,結(jié)果證明福莫特羅能夠減少肺組織內(nèi)ECP的含量。一些研究表明在體外福莫特羅能夠通過抑制血小板或纖維母細(xì)胞等多種途徑抑制EOS的活化,減少炎癥介質(zhì)的釋放,推測在體內(nèi)亦有相同的作用。盡管本實(shí)驗(yàn)觀察到ECP含量降低了,但是尚不能排除EOS數(shù)量變化對ECP含量的影響。

盡管福莫特羅抑制EOS的凋亡,但是本研究結(jié)果表明肺組織內(nèi)EOS的數(shù)量是減少的,與哮喘模型組有顯著性差異。因此我們認(rèn)為福莫特羅對EOS數(shù)量的影響主要是通過eotaxin發(fā)揮作用的而不是抑制細(xì)胞凋亡,至少在短期內(nèi)是這樣的。Wallin等[8]對輕度哮喘患者的研究表明,吸入福莫特羅24μg,每天2次,2個月后氣管黏膜下EOS明顯較對照組減少。但有研究[9]得出相反的結(jié)論,長期規(guī)律應(yīng)用β2受體激動劑患者氣道中EOS數(shù)量增加,但是否與抑制EOS凋亡有關(guān),尚缺乏證據(jù),畢竟影響EOS數(shù)量的因素很多。近年來的研究表明在過敏原的刺激下,肺組織中也有CD34+細(xì)胞存在。Sergejeva等[10]研究哮喘豚鼠肺泡灌洗液中分離的CD34+細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)氣道中的CD34+細(xì)胞能夠表達(dá)IL-5R,不但能夠分化為成熟的EOS,而且自身有增殖的能力,提示CD34+細(xì)胞與IL-5R+細(xì)胞的分化增殖也可能是哮喘肺組織EOS浸潤的一個重要來源。

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8 Wallin AT,Cioppa GD,Holgate S,et al.The effects of regular inhaled formoterol and budesonide on preformed Th-2 cy tokines in mild asthmatics[J].Respir Med,2002,96(12):1021-1025.

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10 Sergejeva S,Johansson AK,Malmhall C,et al.Allergen exposure-induced differences in CD34+cell phenotype:relationship to eosinophilopoietic responses in different compartments[J].Blood,2004,103(4):1270-1277.