陸 敏 王德明 王 焱 田耀洲 夏軍權(quán) 朱方石 王春如 滑永志(江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化科,江蘇南京 210028)

胃黏膜腸上皮化生作為癌前病變,與胃癌發(fā)生有密切聯(lián)系,目前尚無療效滿意的治療藥物。本研究采用復(fù)方植物藥制劑——胃萎寧膠囊治療慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者40例,探討其對患者抑癌基因蛋白PTEN和p16表達的影響。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)備 Olympus H260型前視式高清晰電子胃鏡,CV-260型全數(shù)字電子內(nèi)鏡影像處理機,德國Zeiss公司Microm-340E型石蠟切片機,英國Shandon公司 Hypercenter-XP組織脫水機,英國Shandon公司 Histocentre-2型組織包埋機,HPLAS-1000高清晰彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)。

1.2 研究試劑 均為丹麥Dako公司產(chǎn)品。PTEN試劑:Mouse-Anti-Human,Clone:28H6,Code NO:GT201002。p16試劑:Mouse-Anti-Human,Clone:6H12,Code NO:GT201310。

1.3 研究藥物 胃萎寧膠囊,每粒0.4 g,由江蘇省現(xiàn)代中藥制劑工程技術(shù)研究中心提供,批號:蘇藥制字Z04000321。

1.4 研究對象 萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者共40例,其中男性28例,女性12例,年齡平均59.4±11.6歲。診斷標準按2006年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會制定的《中國慢性胃炎共識意見》。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準,所有研究對象知情同意。

1.5 研究方法

1.5.1 治療方法 萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者均口服胃萎寧膠囊,4粒,每日 3次(餐后),療程60 d。治療前后均行電子胃鏡及病理檢查。

1.5.2 腸上皮化生HE染色 胃黏膜活檢標本均常規(guī)用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,HE染色并切片,依據(jù)固有腺體萎縮程度、黏膜肌層增厚、腸上皮化生、固有膜炎癥、淋巴濾泡形成來檢測。

1.5.3 免疫組化檢測 胃黏膜標本共80個(40對)。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,PBS漂洗,浸泡于3%H 2 O2(20 min)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS(0.05 mmol?L-1,pH 7.4)洗 3次 ,每次5 min。組織切片置于10 mmol?L-1枸櫞酸鈉(pH 6.0)溶液,微波爐中沸騰 10 min,冷卻到室溫,用 PBS(0.05 mmol?L-1,p H 7.4)洗 3次,每次 5 min。滴加正常山羊血清封閉液,室溫 20 min。加入試劑,陰性對照用0.05 mmol?L-1PBS代替一抗。4℃過夜。用 PBS(0.05 mmol?L-1,p H 7.4)洗 3次,每次5 min。滴加生物素化二抗,20～37℃20 min,用 PBS(0.05 mmol?L-1,p H 7.4)洗3次 ,每次5 min。滴加試劑SABC,20～37 ℃20 min,用PBS(0.05 mmol?L-1,pH 7.4)洗 3次,每次5 min。8DAB顯色,蒸餾水洗終止反應(yīng)。

1.5.4 結(jié)果判斷 細胞漿內(nèi)見棕褐色顆粒染色為陽性。每個切片選5個高倍視野,按陽性細胞數(shù)占同類細胞總數(shù)的百分比來計算?！?%為陰性(-),6%～25%為表達陽性(+),26%～50%為表達顯著陽性(++),＞50%為表達強陽性(+++)。并以各細胞表達強度積分:(-)為0分、(+)為1分,(++)為2分,(+++)為3分。觀察染色情況,并進行各組染色強度積分統(tǒng)計。

1.5.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SAS 6.12軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用優(yōu)效性分析,治療前后療效等級比較采用Wilcoxon秩和檢驗。所有假設(shè)檢驗采用雙側(cè)檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者,口服胃萎寧膠囊治療后胃黏膜抑癌基因蛋白第10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白的同源物基因(PTEN)的表達上調(diào)(P＜0.01);抑癌基因蛋白p16表達也上調(diào),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.564)(表1,圖1和圖2)。

表1 抑癌基因蛋白表達結(jié)果(n=40)

3 討 論

慢性萎縮性胃炎與胃癌發(fā)病關(guān)系密切,目前公認的模式為:慢性萎縮性胃炎→胃黏膜腸上皮化生→胃黏膜不典型增生(上皮內(nèi)瘤變)→胃癌。其過程與多基因改變有關(guān),包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活、原癌基因的擴增及癌基因產(chǎn)物的過度表達。

胃萎寧膠囊為國家名老中醫(yī)王德明所創(chuàng),以益氣健脾、行瘀化痰為治則,在臨床已應(yīng)用12年余,頗有良效,具有較完整的制作工藝和藥理學(xué)、毒理學(xué)質(zhì)控標準[1]。本研究采用胃萎寧膠囊治療慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生,并探討了其對抑癌基因蛋白PTEN與p16的作用。結(jié)果顯示治療前后患者胃黏膜抑癌基因蛋白PTEN的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而抑癌基因蛋白p16的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明胃萎寧膠囊作為植物藥復(fù)方制劑,其多途徑、多靶點效應(yīng)的本質(zhì),可能與其上調(diào)抑癌基因蛋白PTEN的表達相關(guān)。

PTEN基因是第1個被發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,已經(jīng)證實PTEN基因的表達水平與多數(shù)消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[2]。大量研究證據(jù)表明PTEN是一個強有力的抑癌基因,其突變頻率可以與p53相匹敵,這些特點使其成為p53之后最引人注目的一種抑癌基因。

PTEN基因的生物學(xué)功能主要包括以下兩個方面:(1)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡中的作用;(2)與細胞粘附、鋪展和遷移行為有關(guān)。細胞黏附力下降為腫瘤轉(zhuǎn)移前提之一,黏著斑(focaladhesion kinase,FAK)為整合蛋白信號分布于黏著斑復(fù)合物,FAK表達的增加和活化在細胞遷移中具有重要作用,而重組PTEN可使FAK體外脫磷酸化。Kang等[3]采用具甲基化特異性PCR檢驗了PTEN的甲基化狀況,在310例胃癌標本中,62例(20%)免疫組化示PTEN表達缺失,這種改變與腫瘤的浸潤深度、大小、淋巴浸潤、進展期及患者的生存率有很大的關(guān)聯(lián)。

PTEN基因被稱為后p53時代突變最多的抑癌基因[4]。PTEN基因表達缺失可促進胃癌血管生成,并在胃癌的進展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用,其表達在胃癌的發(fā)生、進展、生長、分化和血管生成中起重要作用。胃萎寧膠囊上調(diào)了抑癌基因蛋白PTEN的表達,促使腸上皮化生逆轉(zhuǎn),達到抑制胃癌發(fā)生的目的。

腸上皮化生的發(fā)病機制尚處于探索階段,幽門螺旋桿菌毒力因子、腸道特異性轉(zhuǎn)錄因子、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等均參與其發(fā)病環(huán)節(jié),單獨根除幽門螺旋桿菌似乎不足以逆轉(zhuǎn)腸上皮化生,聯(lián)合應(yīng)用其他化學(xué)阻斷劑以及中醫(yī)藥,可能是一條新的治療途徑。而且腸上皮化生和萎縮常呈灶狀分布,有限的幾點活檢標本的代表性以及多次活檢的部位差異性等都可能對最后結(jié)果產(chǎn)生影響,幽門螺旋桿菌定標活檢技術(shù)(marking targeting biopsy,MTB)的應(yīng)用可增加診斷及治療效果評價的準確性[5]。

總之,胃萎寧膠囊治療萎縮性胃炎伴腸上皮化生有臨床療效,其機制可能與其調(diào)控抑癌基因蛋白PTEN的表達相關(guān)。但其有效成分復(fù)雜,對原癌基因的擴增及抑癌基因的作用還需進一步深入探討。

1 陸 敏,王德明,王春如,等.胃萎寧膠囊治療萎縮性胃炎伴腸上皮化生的臨床研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2008,14(9):21-23.

2 常曉華,姜愛民,張 超,等.大腸癌中Survivin、PTEN、p16的表達及其臨床意義[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2007,14(1):31-32.

3 Kang YH,Lee HS,Kim WH,et al.Promoter methy lation and silencing of PTEN in gastric carcinoma[J].Lab Invest,2002,82(3):285-291.

4 Park GS Jo YE,Kim HS,et al.Expression of PTEN and its correlation with angiogenesis in gastric carcinoma[J].Korean JGastroenterol,2005,46(3):196.

5 Si JM,Sun LM,Fang YJ,et al.Trial of a novel end oscopic tattooing biopsy forceps on animai model[J].World J Gastroenterol,2005,11(12):1859-1861.