程秋雁

(江蘇省南京市市級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院藥劑科,江蘇南京,210009)

蛋白質(zhì)和多肽的放射性標(biāo)記廣泛用于藥代動(dòng)力學(xué)研究,醫(yī)學(xué)影像檢查[1],抗體標(biāo)記,二維電泳[2]等方面,在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域是一種重要的技術(shù)。蛋白質(zhì)和多肽的標(biāo)記常用125I或131I標(biāo)記[3-4]酪氨酸。標(biāo)記方法一般是用氯氨 T法進(jìn)行碘放射性標(biāo)記,用柱層析法和離心超濾法對(duì)標(biāo)記物分離純化,同時(shí)用三氯乙酸沉淀法和SDS-PAGE電泳法鑒定純化后的標(biāo)記化合物放射化學(xué)純度,用MT T比色法測(cè)定標(biāo)記物的生物學(xué)活性。例如徐賢坤等[5]改進(jìn)的雙相氯氨 T法標(biāo)記了聚乙二醇化重組人白細(xì)胞介素6標(biāo)記率可達(dá)74.5%,高于常規(guī)氯氨T法的62.3%,放射性比活度分別為5.151 3×109和4.161×109BqPμ g。經(jīng)柱層析法和離心超濾法對(duì)標(biāo)記物分離純化后,用三氯乙酸沉淀法測(cè)得放射化學(xué)純度均能達(dá)到 99%以上。用SDS-PAGE電泳法檢測(cè)2種標(biāo)記方法所得的標(biāo)記物與非標(biāo)記物的結(jié)果表明,常規(guī)氯氨T法標(biāo)記物比非標(biāo)記物多1條高分子量蛋白帶,認(rèn)為是標(biāo)記過(guò)程中蛋白質(zhì)受到部分損傷。改進(jìn)的雙相氯氨T的標(biāo)記物與非標(biāo)記物蛋白質(zhì)條帶一致,認(rèn)為蛋白質(zhì)標(biāo)記后基本沒(méi)有受到損傷。生物活性檢測(cè)表明改進(jìn)的雙相氯氨T標(biāo)記物與非標(biāo)記物活性之間無(wú)顯著差異,常規(guī)氯氨T法標(biāo)記物活性略低于雙相氯氨T的標(biāo)記物活性。

放射性標(biāo)記方法的分類方法有很多,根據(jù)標(biāo)記的過(guò)程不同分為直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法[6]2大類。直接標(biāo)記法的標(biāo)記過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單,在大多數(shù)情況下,放射性核素通過(guò)降解多肽分子內(nèi)的二硫鍵后與自由巰基結(jié)合。直接標(biāo)記法較多應(yīng)用于大分子蛋白質(zhì)諸如抗體及其片斷的標(biāo)記也成功應(yīng)用于血小板受體結(jié)合多肽的標(biāo)記。然而,直接標(biāo)記法的標(biāo)記過(guò)程難以控制,也難以了解標(biāo)記時(shí)多肽參與反應(yīng)的原子數(shù)量和放射性核素絡(luò)合的幾何形狀,并有可能造成多肽的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)發(fā)生不可預(yù)料的改變。對(duì)于不含二硫鍵的多肽直接標(biāo)記法并不適用,即使對(duì)于含二硫鍵的多肽,環(huán)狀結(jié)構(gòu)的微小改變對(duì)其生物活性也會(huì)產(chǎn)生巨大影響。

目前用于蛋白質(zhì)和多肽放射性標(biāo)記的元素有很多,例如3H,18F,99mTc,72As,188Re,75Br,86Yt等等,其中各種元素的標(biāo)記方法和應(yīng)用范圍也不盡相同。作者對(duì)其中幾種元素的放射性標(biāo)記方法做一下簡(jiǎn)單的介紹。

1 放射性砷標(biāo)記

放射免疫治療屬于內(nèi)照射治療,可以用較少的單克隆抗體耦聯(lián)放射性核素,在腫瘤局部產(chǎn)生足夠的電離輻射生物學(xué)效應(yīng),達(dá)到高效低毒的治療效果[7]。Jennewein等[8-9]在傳統(tǒng)的化學(xué)標(biāo)記砷方法得基礎(chǔ)上建立了新方法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行了放射性砷標(biāo)記。長(zhǎng)半衰期的72As(T1/2=26 h)和74As(T1/2=17.8 d)可以減慢生理作用進(jìn)程,類似于濃集腫瘤組織中單克隆抗體的分布。砷標(biāo)記化合物方法重復(fù)性好,且砷標(biāo)記化合物有亞毒性和亞藥動(dòng)學(xué)富集作用。他們標(biāo)記了2個(gè)蛋白,分別是嵌合IgG3單抗ch3G4和利妥昔單抗IgG3。其標(biāo)記方法是:先將抗體用SATA標(biāo)記,隨后在羥胺的作用下脫去作為保護(hù)劑的乙?；?使抗體帶上巰基,巰基化的抗體可以跟72AsI3或74AsI3反應(yīng),得到的產(chǎn)物再水解即砷標(biāo)記的單克隆抗體。這一方法的產(chǎn)率高(>99.9%),并且在臨床環(huán)境中易于操作。

2 188Re標(biāo)記

內(nèi)動(dòng)脈灌注標(biāo)記顆粒是治療腫瘤的一種有效地腔內(nèi)放射療法。Wunderlich等[10]發(fā)展了一種用簡(jiǎn)單可靠的方法對(duì)可降解的人血清蛋白進(jìn)行短半衰期β-發(fā)射粒子188Re標(biāo)記。經(jīng)過(guò)條件的優(yōu)化,這種188Re標(biāo)記方法的標(biāo)記效率可以達(dá)到接近100%,并且188Re標(biāo)記顆粒在體外穩(wěn)定存在。這一方法包括3個(gè)試管,試管1中是9.3 mg(60 μ mol)二羥苯甲酸和 11.4 mg(50 μ mol)氯化琥珀膽堿二羧酸亞錫溶解在2 mL無(wú)菌、無(wú)熱源注射用水中;試管2包括10 mg人血清蛋白微體,2.4 mg吐溫80;試管3包括150 μ mol酒石酸鈉。試管1中的溶液用注射器完全轉(zhuǎn)移到試管2中。輕輕震搖試管使人血清蛋白微體懸浮。一定劑量的188Re轉(zhuǎn)移到含有人血清蛋白的試管2中。為了進(jìn)行反應(yīng),把試管2加熱到95℃,震搖1 h。然后,把試管3中的物質(zhì)溶于1 mL注射用水中,再把試管2中的溶液加到試管3中,室溫震搖10 min。這個(gè)方法可以用一個(gè)簡(jiǎn)單的試劑盒有效的標(biāo)記人血清蛋白顆粒。pH值為2,反應(yīng)90 min,放射標(biāo)記效率為85%～90%,為了避免洗滌步驟,減少放射性風(fēng)險(xiǎn),在反應(yīng)進(jìn)行1h時(shí)加入酒石酸銻鉀,然后pH值從2提高到4～5,發(fā)現(xiàn)188Re反應(yīng)幾乎可以定量。

3 3H標(biāo)記

糖蛋白的定點(diǎn)P-糖蛋白(Pgp)是ATP依賴藥物泵,用于抵抗多重耐藥的癌細(xì)胞。Andrus[11]等得到了一種新的抗多重耐藥的癌細(xì)胞的天然化合物:(-)-stipiamide,但是毒性很高。于是其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾得到了無(wú)毒的化合物6,7-dehydrostipiamide和truncated-DHS。先合成了DHS,然后用放射性試劑[3H]-BZDC對(duì)DHS進(jìn)行放射性標(biāo)記,得到了一種新型放射性抗癌試劑。然后,用放射性標(biāo)記試劑與Pgp進(jìn)行光親和性反應(yīng)在365 nm照射下反應(yīng)1 h,用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)加入環(huán)孢菌素A后,標(biāo)記效率提高,大部分Pgp被標(biāo)記。

另外,3H標(biāo)記還可以用于蛋白質(zhì)相互作用的足跡分析。Mousseau[12]等利用穩(wěn)定的C-3H共價(jià)鍵標(biāo)記對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用進(jìn)行了分析,得到了較好的效果。

4 11C標(biāo)記

11C的半衰期為20.4 min,可以用穩(wěn)定的共價(jià)鍵與蛋白結(jié)合。常用的11C標(biāo)記試劑是11C標(biāo)記的CNBr,11C標(biāo)記的CH2O,11C標(biāo)記的CH3I等。其中[11C]CNBr可以將轉(zhuǎn)鐵蛋白和人血清白蛋白在接近生理?xiàng)l件下(40℃,5 min,pH值8)高特異性標(biāo)記上[13]。其放射性隨蛋白含量2增加到25 mg/mL而從20%增加到70%～80%。盡管游離的巰基也可以與[11C]CNBr反應(yīng),但是[11C]CNBr還是優(yōu)先與賴氨酸的氨基反應(yīng)。整個(gè)反應(yīng)時(shí)間在30 min之內(nèi),標(biāo)記后半衰期為20 min,可以用于檢測(cè)血管和肺的滲透性以及紅細(xì)胞比容的分布。[11C]CH2O可以磷酸鹽緩沖液中與人血清白蛋白,纖維蛋白原或促黃體激素的氨基反應(yīng),然后在硼氫化鈉的作用下發(fā)生還原反應(yīng),形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。[11C]CH3I是應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記前體,人血清白蛋白可以在磷酸鹽中與[11C]CH3I發(fā)生反應(yīng)。但是人血清白蛋白的耐熱能力比一般蛋白要強(qiáng),所以這些條件并不適合其他蛋白的標(biāo)記。例如錨定蛋白在甲醇中與[11C]CH3I加熱到80℃反應(yīng)時(shí)難以保持活性的。因?yàn)檫@一蛋白在56℃加熱10 min就會(huì)完全失去活性[14-15]。

5 18F標(biāo)記

18F的半衰期為110 min,18F用于親和標(biāo)記的在高pH和溫度以及有機(jī)溶劑中進(jìn)行,這些條件會(huì)破壞蛋白的生物學(xué)活性。因此蛋白要與18F標(biāo)記的輔基反應(yīng)。這些輔基必須可以快速與蛋白上的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。大多數(shù)18F的輔基都是與蛋白上的N-末端氨基或多個(gè)賴氨酸的氨基發(fā)生反應(yīng),選用蛋白中含量較高的賴氨酸含量大大增加了標(biāo)記的可能性,但是選擇性不高。[18F]氟苯甲醛([18F]FBA)與蛋白的氨基反應(yīng),因此最近報(bào)道的標(biāo)記策略傾向于更加有選擇性的方法,例如巰基修飾策略。大多數(shù)巰基選擇性修飾劑都是針對(duì)半胱氨酸殘基的。由于大多數(shù)蛋白中只有少數(shù)半胱氨酸,所以特異性標(biāo)記還是可以實(shí)現(xiàn)的。[18F]FBABM對(duì)于模式多肽在PBS中反應(yīng)10 min有很高的產(chǎn)率,但是這個(gè)分子中含有一個(gè)雜質(zhì)從而降低蛋白的量。當(dāng)雜質(zhì)除去后,其修飾錨定蛋白v巰基的產(chǎn)率達(dá)到37%。[18F]FBABM也可以成功的標(biāo)記低密度膜蛋白,產(chǎn)率也達(dá)到了20%。另外還有其他的標(biāo)記策略,例如一種18F標(biāo)記的新方法是用Al18F作為標(biāo)記試劑,Al18F可以作為螯合劑與多肽穩(wěn)定結(jié)合[16-18]。

結(jié) 語(yǔ)

蛋白質(zhì)和多肽的放射性碘標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成熟,應(yīng)用也很廣泛。其他的放射性標(biāo)記技術(shù)也在蓬勃發(fā)展,放射性元素的種類在不斷的增加,標(biāo)記策略呈現(xiàn)多樣性,并且蛋白質(zhì)和多肽的放射性標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用的范圍也得到了擴(kuò)大。

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