郁俊德

神經(jīng)生長因子 NGF是神經(jīng)系統(tǒng)最主要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一,它通過效應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞上的受體 trkA結(jié)合,能誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長,控制神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量和分化,促進損傷神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù),參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程。新生兒缺血缺氧性腦損傷是新生兒常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,病死率和致殘率高,是嚴(yán)重威脅新生兒生命和健康的疾病之一,為了觀察 NGF對新生大鼠 HIE的保護作用,本實驗采用新生大鼠 HIE模型進行NGF保護 HIE的作用的研究。

1 資料與方法

1.1 實驗動物和分組 新生 7d齡 Wistar大鼠購買自中科院上海實驗動物中心,體質(zhì)量 9～17g,雌雄不限,隨機分為假手術(shù)組 (僅分離左側(cè)頸總動脈,不結(jié)扎)、HIE組、NGF治療組。

1.2 實驗藥物和儀器 神經(jīng)生長因子動干粉:本實驗室提供,臨用時用 0.9%氯化鈉溶液稀釋至一定濃度。0.9%氯化鈉溶液:蘇州第六制藥廠。氮氧混合氣 (氧濃度 8%):上海五鋼氣體公司。電熱恒溫水溫箱:上海醫(yī)療器械七廠。

1.3 方法

1.3.1 HIE模型的建立和給藥方法 7d齡新生大鼠仰位固定在手術(shù)板上,酒精消毒頸部皮膚,剪開頸部皮膚,分離左側(cè)頸總動脈并用 0號線永久結(jié)扎,用 5/0號縫合線一次性縫合切口,手術(shù)在白熾燈下進行。術(shù)后將大鼠直接放入自制的新生大鼠缺氧裝置中[1],2h后取出,制成 HIE模型,返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。NGF組術(shù)前半小時和缺氧后都注射 NGF,其他組注射 0.9%氯化鈉溶液。劑量分別為:NGF 0.02mg/10g,0.9%氯化鈉溶液 0.25mg/10g。

1.3.2 免疫組化檢測 新生大鼠在制成模型并喂養(yǎng) 44h后,處死并取出腦組織,均勻分離左右半腦,放入 4%的多聚甲醛進行固定 24h,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、組織切片 (4μm厚)、分別進行蘇木素-伊紅 (HE)染色和免疫組化檢測,包括促進細(xì)胞凋亡的 p53蛋白和抑制細(xì)胞凋亡基因 bcl-2[2]。每次實驗均設(shè)陰性對照,以 PBS代替一抗。陽性反應(yīng)為胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色染色,陰性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)無棕黃色。在高倍鏡下觀察同一實視野下 100個細(xì)胞中棕黃色顆粒數(shù)來計算 p53和 bcl-2的表達(dá)。

2 結(jié)果

HIE組 p53表達(dá)明顯高于假手術(shù)組,NGF干預(yù)后 p53下降顯著;而 bcl-2正好相反,HIE組較假手術(shù)對照組表達(dá)降低,NGF干預(yù)組 bcl-2表達(dá)顯著增加 (P＜0.05,見表1)。

表1 3組各指標(biāo)比較Table1 Comparison ofsome indexes in three groups

3 討論

NGF是一種多亞基蛋白組成的靶組織源性修復(fù)細(xì)胞因子,它的生物學(xué)活性分為兩種[3]:一是使神經(jīng)細(xì)胞存活率增高的活性 (生存活性);二是促進神經(jīng)細(xì)胞突起的伸長的活性 (神經(jīng)突起伸長活性)。具體表現(xiàn)在以下幾方面:(1)NGF促進發(fā)育中的交感和感覺神經(jīng)細(xì)胞的分化和成熟,維持交感神經(jīng)元的正常功能。(2)促進離體培養(yǎng)的交感神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元突起的長出。誘導(dǎo)突起向 NGF濃度高的方向生長,決定神經(jīng)纖維生長的方向,具有趨化性,表現(xiàn)在細(xì)胞器增大,酶合成活性增加。(3)促進神經(jīng)細(xì)胞內(nèi) Ca2+向細(xì)胞外釋放。(4)影響免疫系統(tǒng)的肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的功能。(5)NGF可抑制某些腫瘤的有絲分裂,促其向良性分化,延長患者的存活期。(6)NGF可促進創(chuàng)傷組織細(xì)胞的修復(fù)反應(yīng),促進傷口愈合。

NGF對神經(jīng)細(xì)胞保護作用的機制可能與以下幾方面有關(guān)[4]:(1)提高自由基清除劑的活力。因為在各種腦損傷時,腦組織中氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧反應(yīng)均異?；钴S,NGF能增加過氧化氫酶、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱光肽、谷胱光肽過氧化酶等自由基清除劑的活性,從而減輕腦損傷。(2)拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性。興奮性氨基酸 (EAA)參與了多種原因所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷和死亡。在腦缺血缺氧時,腦內(nèi) EAA釋放增多,從而持續(xù)的刺激 EAA受體 (包括NMDA和非 NMDA受體)引起的神經(jīng)元興奮性損傷。NGF具有抵消 EAA興奮毒性的作用。目前認(rèn)為,NGF并不能減少NMDA受體的表達(dá),但能影響細(xì)胞膜上的離子泵,如 NGF穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi) Na+/K+濃度比,緩解 EAA的神經(jīng)毒性。也有人認(rèn)為,NGF通過激活 trkA受體引起細(xì)胞內(nèi)一系列繼發(fā)性變化,如改變谷氨酸受體對刺激的反應(yīng)性。(3)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度。自由基和 EAA損傷均可引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載,鈣超載將預(yù)示細(xì)胞發(fā)生破壞和死亡。NGF穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的機制在于誘導(dǎo)鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)、影響鈣通道與鈣排出系統(tǒng)的表達(dá)和活化,從而促進 Ca2+的排出和 (或)緩沖細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的上升,以及減少 Ca2+的內(nèi)流。

細(xì)胞凋亡在缺血缺氧性腦細(xì)胞受損的重要機制[5],最近一些研究提示遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[6]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在生理或病理條件下的一種主動死亡方式,是受細(xì)胞內(nèi)基因及細(xì)胞外一些因子調(diào)控的生物學(xué)過程[7]。

本實驗是采用觀察缺血缺氧后新生大鼠腦組織中 p53、bcl-2的表達(dá)來探討 NGF對缺血缺氧腦損傷的保護。其中,p53在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起重要的作用,野生型 p53可以抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生,正常 p53功能的改變或缺失與大量不同種類的人類腫瘤細(xì)胞有密切關(guān)系。p53還被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激的關(guān)鍵性調(diào)控分子之一,能整合各種不同細(xì)胞危急事件的信號,通過轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄途徑對這些信號做出包括細(xì)胞生長抑制或凋亡在內(nèi)的不同反應(yīng)。還有研究認(rèn)為正常 p53在體內(nèi)扮演 “分子警察”的角色,監(jiān)視細(xì)胞基因組的完整性。許多研究表明,多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡都有 p53基因的參與。而 bcl-2是 80年代從濾泡性淋巴瘤細(xì)胞中分離發(fā)現(xiàn)的一種癌基因,其過度、異常的表達(dá)可以抑制包括淋巴細(xì)胞的凋亡過程,具有延緩細(xì)胞衰亡的作用,故被稱為 “細(xì)胞長壽基因”,能抑制許多因素引起的細(xì)胞凋亡。大量研究表明,bcl-2表達(dá)在多種造血細(xì)胞、某些正常上皮和乳腺癌、肺癌、前列腺癌等上皮惡性腫瘤中,由于 bcl-2表達(dá)與癌前病變組織密切相關(guān),提示 bcl-2是在腫瘤發(fā)生早期起作用,而并不影響腫瘤的增殖。本實驗中,HIE組中由于沒有 NGF的治療,腦中 p53的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組,在高倍鏡中能明顯觀察到新生大鼠腦組織中典型的細(xì)胞凋亡形態(tài):細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核固縮、核碎片和凋亡小體的形成。NGF治療組中,p53則又明顯低于 HIE組,說明 NGF對缺血缺氧性腦損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有治療作用。假手術(shù)組的 p53和 bcl-2屬正常表達(dá)。因此本實驗結(jié)果顯示 NGF對缺血缺氧性腦損傷有保護作用,這與大量的文獻(xiàn)報道一致。另外 NGF是一種大分子多肽,腹腔注射后作用于腦組織是由于新生大鼠血腦屏障發(fā)育的不完善,同時缺血缺氧進一步損傷了血腦屏障。

1 陳惠金,周建德.新生大鼠實驗裝置的研制 [J].上海實驗動物科學(xué),1999,19(1):45.

2 駱純,朱誠,盧亦成,等.大鼠液壓腦損傷后 bcl-2、bcl-x和Bax的蛋白表達(dá)的改變 [J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2001,22(1):54-56.

3 劉思渝.神經(jīng)生長因子及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)中的作用[J].Foreign Medical Sciences Section on Neurology＆Neurosurgery,2001,28(2):112-114.

4 賀雙騰.缺血性腦損傷時神經(jīng)生長因子的表達(dá) [J].國外醫(yī)學(xué)-腦血管疾病分冊,1998,6(1):13-16.

5 胡樺,崔堯元.腦缺血與細(xì)胞凋亡 [J].生命科學(xué),1998,10(1):25-27.

6 Nitatori T,Sato N,Waguri S,et al.Delayed neuronal death in the CA 1 pyram idal cell layer of the gerbilhippocampus following transientischem ia is apoptosis[J].JNeurochir,1995,15:1001.

7 高東,王景周.抗細(xì)胞凋亡治療缺血性卒中的研究進展 [J].國外醫(yī)學(xué)-腦血管疾病分冊,2000,8(6):349.