馮蔚宗，王冰冰，林雅靜，林 琳

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108）

脂肪酶是一種作用在油水界面上的界面酶，廣泛用于造紙、食品、藥物手性拆分、洗滌、能源、飼料加工等行業(yè)。羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）是一種頡頏菌，廣泛用于果蔬病蟲害的生物防治方面，我國對羅倫隱球酵母的研究也主要集中在其對果蔬病蟲害的生物防治、生長特性研究、產(chǎn)胞外多糖及其凍干粉活性和貯藏期安全性的研究等方面[1-8]。對其可產(chǎn)脂肪酶的特性研究報道較少[9-10]。本文對羅倫隱球酵母所產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行了分離純化，獲得了單一脂肪酶，并對其進(jìn)行N端測序，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅倫隱球酵母B40（本實(shí)驗(yàn)室保存菌種），（NH4）2SO4（由西隴化工生產(chǎn)），DEAE Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow、DEAE Sep-hardex A-25（G.E.），QAE Sepharose F.F.（由杭州爭光生產(chǎn)），CM Sepharose F.F.（由杭州爭光生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)（HITACHI，Himac CR21GⅡ）、蛋白質(zhì)純化設(shè)備（上海琪特，HD-21-88型）、超濾濃縮裝置（MICON，Model 8050）、內(nèi)切式高速分散器（其林貝爾，GF-1型）、垂直電泳儀（BIO RAD PowerPac Universal）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)菌體發(fā)酵

按羅倫隱球酵母B40產(chǎn)酶優(yōu)化條件發(fā)酵得發(fā)酵液，4℃、10 000 rpm離心20min得發(fā)酵上清液[10]。

1.3.2 脂肪酶的分離純化

發(fā)酵上清液分別用20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的硫酸銨分別沉淀2、4、6、8 h，4℃、10 000 rpm離心20 min，保留上清液和沉淀，沉淀用 20 mol·L－1pH 8.6 的 Tris－HCl緩沖液重新溶解，取8μL點(diǎn)在三丁酸甘油酯板上，用平板透明圈法測定每種硫酸銨飽和度下，鹽析不同時間的沉淀和上清液在板上形成的透明圈大小，確定最佳的硫酸銨飽和度和沉淀時間。

將上述沉淀溶解液裝入透析袋，分別用蒸餾水透析 4 h，20 mol·L－1pH 8.6 的 Tris－HCl緩沖液透析8 h，每次4 h，共2次，獲得粗酶液。

取100μL粗酶液與50μL離子交換填料（DEAE Sepharose F.F.、 DEAE Sephardex A －25、 QAE Sepharose F.F.、SP Sepharose F.F.、CM Sep－h(huán)arose F.F.）混勻，分別置于 500 μL 不同 pH（6.0、7.0、8.0、9.0）的 20mol·L－1Tris－HCl緩沖體系（其中 pH 6.0和7.0的緩沖體系為NaH2PO4－Na2HPO4緩沖體系）中，靜置過夜。4℃、1 000 rpm離心沉淀填料5 min，取上清液8μL點(diǎn)板，沉淀用 500μL含0.5mol·L－1NaCl、對應(yīng) pH的緩沖體系重懸，靜置2 h，4℃、1 000 rpm離心沉淀填料5 min，取上清液8μL點(diǎn)板，觀測形成的透明圈大小。

取上述粗酶液過DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱，分別用含50、100、150、500、1 000 mol·L－1NaCl的 20mol·L－1pH 9.0 的 Tris－HCl緩沖液進(jìn)一步洗脫，收集各管，點(diǎn)在三丁酸甘油酯瓊脂板上，分段收集合并有酶活的各管，超濾濃縮上述各管，取15μL酶液進(jìn)行SDS－PAGE變性電泳。

1.3.3 脂肪酶的N端測序

取上述超濾濃縮后的酶液進(jìn)行SDS－PAGE變性電泳，用轉(zhuǎn)膜儀將膠上的目的蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，輕微染色、脫色，晾干后送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行蛋白質(zhì)N端測序。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳硫酸銨飽和度和沉淀時間的確定

鹽析是蛋白分離濃縮中的常用方法，其操作簡便，但高離子強(qiáng)度溶液的長時間作用可能降低酶的活性，因此進(jìn)行了硫酸銨飽和度和沉淀時間的試驗(yàn)，以確定最佳的鹽飽和度和沉淀時間。

在肉眼可以區(qū)分酶在底物平板上水解的透明圈大小時，本試驗(yàn)測量了水解圈的直徑來間接衡量殘留在上清中的目的蛋白和鹽析沉淀的目的蛋白，不同離子強(qiáng)度和作用時間下鹽析結(jié)果見圖1。

圖1 鹽析離子強(qiáng)度與作用時間分析

結(jié)果表明，在60%與70%的硫酸銨飽和濃度下，沉淀6 h可以使目的蛋白的沉淀量達(dá)到較大且活性較高。

2.2 不同pH下各種填料對目的蛋白的頡頏效果

為了得到能夠較好地純化目的蛋白的離子交換填料，本試驗(yàn)研究了不同pH下各種填料對目的蛋白的掛柱效果，見圖2。

當(dāng)出現(xiàn)目的蛋白全部掛柱，而雜質(zhì)全部不掛柱；目的蛋白全部不掛柱，而雜質(zhì)全部掛柱的兩種情況時，可認(rèn)為該pH條件下填料較好。含NaCl 500 mol·L-1的洗脫緩沖液可以將多數(shù)蛋白和雜質(zhì)洗脫下來，若該洗脫液點(diǎn)板形成的透明圈大而對應(yīng)的無NaCl的緩沖液離心上清點(diǎn)板透明圈小或無，則表明該填料能很好地吸附目的蛋白，反之則不能很好地吸附目的蛋白，但可能可以很好地吸附雜質(zhì)，這就需要用電泳進(jìn)一步篩選。

圖2（a）表明處于 pH 9.0，20mol·L-1Tris-HCl緩沖體系的DEAE Sepharose Fast Flow離子交換填料能夠較好地吸附目的蛋白，而SP Sepharose F.F.和 CM Sepharose F.F.填料則很難掛柱蛋白，圖2（b）表明，這兩種填料也很難吸附雜質(zhì)（如雜蛋白），泳道上無任何條帶，而 DEAE Sep-harose F.F.則能較好地吸附蛋白，不吸附雜質(zhì)。因此應(yīng)選擇過DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱，緩沖體系為 pH 9.0，20mol·L－1的 Tris-HCl溶液。

2.3 目的蛋白的洗脫

DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱步進(jìn)洗脫曲線圖見圖3。

圖2 目的蛋白在不同pH下各離子交換柱填料中的掛柱效果

圖3 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱步進(jìn)洗脫曲線

過DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱，含NaCl 100 mol·L-1的洗脫緩沖液能將大量目的蛋白洗脫下來，電泳獲得該脂肪酶蛋白的分子質(zhì)量約為44.3，這與王彩梅等報道的脂肪酶蛋白分子質(zhì)量為21不同[10]，表明羅倫隱球酵母能產(chǎn)生至少兩種的脂肪酶，在本試驗(yàn)的分離純化條件下能夠獲得與王彩梅等分離純化條件下不同的脂肪酶。

由圖3可知，從左到右形成的3個峰分別為50、100、150 mol·L-1NaCl洗脫峰，上方是對應(yīng)的洗脫液濃縮后點(diǎn)三丁酸甘油酯板圖，其中100 mol·L-1NaCl洗脫液點(diǎn)板形成的透明圈最大，150 mol·L-1次之，50 mol·L-1沒有透明圈。

2.4 脂肪酶的N端測序

純化后脂肪酶液SPS－PAGE電泳見圖4。N端經(jīng)上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測序獲得該脂肪酶N端的 12個氨基酸，其序列為：D-F-G-P-I-T-IY-T-P-P-A。

圖4 純化后脂肪酶液SDS-PAGE電泳圖譜

3 小結(jié)

能源與環(huán)境問題已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。脂肪酶作為一種生物催化劑，可以催化多種酯交換、合成反應(yīng)。其催化條件溫和、能耗低、原料要求低、不易產(chǎn)生副產(chǎn)物。正是這些優(yōu)點(diǎn)，脂肪酶在新能源生產(chǎn)、環(huán)境改良等方面發(fā)揮著重要的作用。環(huán)境中微生物產(chǎn)出的脂肪酶酶學(xué)特性與其所處環(huán)境相適應(yīng)，這就為脂肪酶的研究應(yīng)用提供了很好的篩選條件。章文賢等篩選到的羅倫隱球酵母野生菌株所產(chǎn)脂肪酶最適溫度為 50℃，pH為9.2[11]。本研究在前期研究工作的基礎(chǔ)上通過對羅倫隱球酵母脂肪酶進(jìn)行 65%硫酸銨濃度，沉淀 6 h，過DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱分離純化，獲得脂肪酶測得的N端12個氨基酸為D-F-G-P-I-T-IY-T-P-P-A，這為該脂肪酶基因的克隆表達(dá)提供了前提條件。

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