任克寧，張福元，牛 嵐，王瑩瑩

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

山西晉南地區(qū)是我國優(yōu)質(zhì)蘋果主產(chǎn)區(qū)之一，蘋果種植面積多達20多萬公頃，年產(chǎn)蘋果350萬t以上。隨著山西全省產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的深化改革，蘋果加工業(yè)在這一地區(qū)及其周邊地區(qū)逐步興起，同時不可避免地產(chǎn)生了大量的蘋果渣。但目前我國對蘋果渣再利用的研究主要集中在初步應(yīng)用階段，除少量被用于燃料、肥料和深加工外，絕大部分被遺棄，造成了資源的嚴重浪費。因此，為充分利用資源，增加果汁企業(yè)的經(jīng)濟效益，迫切需要對蘋果渣進行開發(fā)。

已有大量試驗證明，用生物方法處理的果渣不僅蛋白含量有顯著提高，而且含有豐富的氨基酸等營養(yǎng)成分[1-5]。糞鏈球菌和啤酒酵母是農(nóng)業(yè)部公布的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑，其對改善動物體內(nèi)外生態(tài)環(huán)境、增強動物免疫功能等方面有較大改觀。本試驗以糞鏈球菌和啤酒酵母菌株混合發(fā)酵蘋果渣，發(fā)揮多菌株間的協(xié)同作用，不但提高了產(chǎn)品中真蛋白的含量，同時具有微生態(tài)制劑的功效。因此，經(jīng)過混菌發(fā)酵后的產(chǎn)品具有良好的飼用價值，這不失為充分利用蘋果渣資源的一條有效途徑。

本試驗先進行了單因素實驗探索發(fā)酵條件，再通過正交實驗優(yōu)化發(fā)酵條件和分析對發(fā)酵過程的影響因素，從而確定蘋果渣生產(chǎn)生物飼料的工藝條件，以期為大規(guī)模以蘋果渣為主要原料生產(chǎn)生物飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 發(fā)酵材料

蘋果渣購于太谷縣金谷源蔬食加工廠（果源來自運城市臨猗縣）；麩皮、尿素等在市場購買。

1.2 菌種

糞鏈球菌（Fecal streptococcus）、啤酒酵母菌（Saccharomyces cererisiae）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院食用菌實驗室保藏，分別保存于CICC500#培養(yǎng)基和麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基斜面上。

1.3 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基。CICC500#培養(yǎng)基：番茄汁400 mL，葡萄糖 10 g，鹽溶液 A 5 mL（KH2PO42.5 g，K2HPO42.5 g，水 250 mL），鹽溶液 B 5 mL（MgSO4·7H2O 10 g，MnSO4·4H2O 5 g，F(xiàn)eSO45 g，NaCl 5 g，水250 mL），酵母浸膏10 g，碳酸鈣20 g，蒸餾水600 mL，瓊脂2.0%，pH 6.8～7.0，用于培養(yǎng)糞鏈球菌；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)啤酒酵母菌，參照微生學(xué)制備[6]。

二級種子培養(yǎng)基。CICC500#液體培養(yǎng)基（CI CC500#培養(yǎng)基不加瓊脂）：用于糞鏈球菌的二級種子液培養(yǎng)；麥芽汁液體培養(yǎng)基：4°Bix麥芽汁，（NH4）2SO40.24%，（NH4）2CO30.12%，KH2PO40.1%，121℃，0.1 Mpa滅菌30 min，用于酵母菌的二級種子液培養(yǎng)。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基。分別稱取蘋果渣80%，麩皮 20%，添加（NH4）2SO41%、MgSO41%、KH2PO41%、尿素2%、NaSO31%、葡萄糖 2%、料水比為1：1，然后進行拌料并裝瓶，裝瓶后高壓滅菌30 min。

2 試驗方法

2.1 二級種子培養(yǎng)基的稀釋

啤酒酵母二級種子培養(yǎng)基的稀釋：按常規(guī)方法先計數(shù)再按比例稀釋，菌濃度在 1.0×1010個·mL－1；糞鏈球菌二級種子培養(yǎng)基的稀釋方法同上，菌濃度為 1.0×109個·mL－1。

2.2 真蛋白含量和酵母菌數(shù)測定

真蛋白含量按司翔宇等的方法測定[7]；酵母菌數(shù)的測定按GB/T4789.15-2003執(zhí)行[8]。

2.3 生產(chǎn)工藝流程

生產(chǎn)工藝按圖1進行。

圖1 生產(chǎn)工藝流程圖

2.4 混菌固態(tài)發(fā)酵條件的研究

2.4.1 不同發(fā)酵溫度的研究

每個處理分別稱取30 g固體培養(yǎng)基裝入罐頭瓶，混菌接種比例為1:1，接種量10%，分別在24、26、28、30、32、34℃ 下進行培養(yǎng)，4 d后測定不同溫度下，發(fā)酵物中真蛋白含量和酵母菌個數(shù)。

2.4.2 不同混菌接種比例的研究

在2.4.1確定的溫度下，每個處理分別稱取30 g固體培養(yǎng)基裝入罐頭瓶中，混菌接種比例為1：1，分別將糞鏈球菌和啤酒酵母以 1： 0.5、1： 0.8、1：1、1： 1.2、1： 1.4、1： 1.6 的比例，按 10% 的接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后，測定真蛋白含量和酵母菌個數(shù)。

2.4.3 不同混菌發(fā)酵時間的研究

在2.4.1確定的溫度和2.4.2確定的接種比例下，每個處理稱取30 g固體培養(yǎng)基裝入罐頭瓶中，分別發(fā)酵1、2、3、4、5、6 d，每天提取樣品測定真蛋白含量和酵母菌個數(shù)。

2.4.4 不同混菌發(fā)酵瓶裝量的研究

在上述確定的條件下，處理步驟同上，分別將瓶裝量控制在 15、20、25、30、35 g·瓶－1發(fā)酵，并測定不同瓶裝量混菌發(fā)酵物中的真蛋白含量和酵母菌個數(shù)。以上試驗步驟均重復(fù)3次。

2.4.5 確定工藝條件的正交實驗設(shè)計

分別取發(fā)酵溫度、菌種比例、發(fā)酵時間、瓶裝量4個因素較好的3個水平設(shè)計正交試驗，試驗采用L9（34）的設(shè)計方案。

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳發(fā)酵溫度的選擇

不同發(fā)酵溫度對真蛋白含量和活酵母數(shù)的影響見圖2。

由圖2可知，溫度對混合菌種的生長繁殖影響較大，在培養(yǎng)溫度為28℃時，真蛋白含量和活酵母數(shù)均達到最大值，34℃時酵母存活量已經(jīng)很少。因此將混菌發(fā)酵溫度控制在28℃最為適宜，此時，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量較高，酵母菌個數(shù)較多。

3.2 混菌接種比例的確定

不同接種比例對真蛋白含量和活酵母數(shù)的影響見圖3。由圖3可見，不同接種比例會影響菌體生長繁育。發(fā)酵物中真蛋白的含量在混菌接種比例為1：1.2時達到最大值。因此，初步確定接種比例為1：1.2時發(fā)酵效果較好。

3.3 混菌發(fā)酵時間的確定

不同發(fā)酵時間對真蛋白含量和活酵母數(shù)的影響見圖4。

由圖 4可知，混菌發(fā)酵5 d后，產(chǎn)物真蛋白含量和活酵母數(shù)均達到最大值，發(fā)酵5 d后有小幅度下降趨勢。這可能是由于隨著發(fā)酵時間的延長，微生物進入衰老期，部分發(fā)生自溶。因此，將混菌發(fā)酵時間初步確定為5 d。

3.4 混菌發(fā)酵瓶裝量的確定

不同瓶裝量對真蛋白含量和活酵母數(shù)的影響見圖5。

由圖5可知，在瓶裝量為25 g·瓶－1時真蛋白含量和活酵母數(shù)均達到最大值。所以適宜的瓶裝量確定在 25 g。

3.5 混菌發(fā)酵蘋果渣確定工藝條件的正交試驗結(jié)果與分析

按試驗2.4.5的設(shè)計方案，采用2.3的發(fā)酵工藝，混菌種共發(fā)酵的正交試驗結(jié)果見表1～2。

表1 混菌發(fā)酵蘋果渣確定工藝條件的正交試驗結(jié)果

表2 混菌發(fā)酵蘋果渣確定工藝條件的正交實驗結(jié)果分析

由表1～2可知，影響真蛋白含量的各因素最佳水平為 D2B3A2C2，即發(fā)酵溫度為28℃，接種比例為 1：1.2，發(fā)酵時間為 5 d，瓶裝量為 25 g·瓶-1，這與單因素試驗結(jié)果相同；由R值可知，瓶裝量對發(fā)酵產(chǎn)真蛋白影響最大，其次是接種比例，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間影響最小。

影響活酵母數(shù)的各因素最佳水平為B3A2D2C2，即發(fā)酵溫度為28℃，接種比例為1：1.2，發(fā)酵時間為 5 d，瓶裝量為25 g·瓶－1，這與單因素試驗結(jié)果一致；由R值可知，接種比例對發(fā)酵后活酵母數(shù)影響最大，其次為發(fā)酵溫度、瓶裝量，發(fā)酵時間影響最小。

4 討論

由單因素試驗和正交試驗結(jié)果分析可知，影響真蛋白含量和活酵母菌數(shù)的各因素的最佳水平是一致的，這說明在最佳水平下，啤酒酵母是優(yōu)勢菌種，糞鏈球菌在混菌發(fā)酵過程中起輔助作用；且在各因素最佳水平下混菌發(fā)酵后，真蛋白含量和活酵母菌數(shù)分別為13.51% 和23.27億個·g－1，產(chǎn)物具有芳香氣味，適口性有較大改觀，產(chǎn)品具有蛋白飼料和微生態(tài)制劑雙重特性。

試驗中各因素對真蛋白含量和活酵母菌數(shù)影響程度不同；在所選擇的發(fā)酵時間范圍內(nèi)，菌種生長基本處于穩(wěn)定期，其對真蛋白含量和活酵母菌數(shù)影響最小；接種比列直接控制優(yōu)勢菌種的形成和發(fā)酵過程中不同菌種之間的關(guān)系；而瓶裝量主要影響混合菌種發(fā)酵的外環(huán)境，如氧氣、散熱狀況等，因為不同菌種對外環(huán)境的要求是不同的；溫度對混菌發(fā)酵過程影響很大，任何菌種都有自己最適合的生長溫度，則選擇合適的發(fā)酵溫度在發(fā)酵過程中很重要。

5 結(jié)論

上述試驗結(jié)論和分析可以看出，不同的培養(yǎng)條件對混菌發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)生物飼料有著不同程度的影響，通過對糞鏈球菌和啤酒酵母菌種發(fā)酵生物飼料的試驗得出，混菌固態(tài)發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)生物飼料的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度28℃、混菌菌株接種比例1：1.2、混菌發(fā)酵時間 5 d、瓶裝量 25 g·瓶－1；混菌發(fā)酵蘋果渣中所用釀酒酵母菌和糞鏈球菌之間有很好的協(xié)同性，真蛋白含量和活酵母菌數(shù)較高，分別為13.51% 和 23.27億個·g－1，產(chǎn)物具有芳香氣味，適口性較發(fā)酵前有較大改觀，說明其是一種良好的飼用飼料。

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