朱宏飛 馮 丹 姚尚龍 武慶平

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科,武漢 430022

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)不只存在于心血管系統(tǒng),研究表明,在人和大鼠肺組織中,也存在RAS,并對肺組織細(xì)胞的生長、凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用,其中尤以血管緊張素Ⅱ(ANG Ⅱ)及其1型受體(AT1)較為關(guān)鍵[1]。近些年來研究發(fā)現(xiàn),肺損傷時肺組織ANGⅡ的含量顯著增加,而減少ANG Ⅱ的生成或阻斷AT1可以減輕多種原因所致的肺損傷[2-4];Marshall等[5]的一項大規(guī)模前瞻性研究也表明,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑的活性關(guān)系到ARDS的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后,提示RAS可能在急性肺損傷的致病機制中起著非常重要的作用。目前,有關(guān)RAS在機械通氣肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)中的作用還少見報道。本實驗主要研究大鼠VILI時RAS的激活情況。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

小動物呼吸機(哈佛683,美國);血氣分析儀(i-State,美國);石蠟切片機(Leika超薄切片機,德國);PCR 儀(Bio-Rad MJ PTC-100TM,美國);半干式轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad 170-3940,美國);酶標(biāo)儀(Biorad 680,美國)。T rizol提取液、RT-PCR試劑盒及ANG ⅡELISA試劑盒(深圳晶美公司);總蛋白和MPO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);ACE一抗(Santa Cruz,美國);ECL檢測試劑盒(Amersham,美國)。

1.2 動物與分組

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部動物實驗中心內(nèi)進行實驗,中心合格證號:SYXK(鄂)2004-0028。24只健康雄性SD大鼠(同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供),體重300～350 g,隨機分成4組(每組6只大鼠):A為空白對照組,不行機械通氣;B、C、D組均在20%烏拉坦腹腔注射麻醉起效后,行氣管切開,插入氣管導(dǎo)管(用14～16號靜脈穿刺套管針外套管自制)接小動物呼吸機行機械通氣,通氣時間分別為1、2和4 h,機械通氣參數(shù)參考Karzai等[6]的相關(guān)研究統(tǒng)一設(shè)置為:潮氣量(VT):40 mL/kg,呼吸頻率(RR):40次/min,吸/呼比(I∶E)為 1∶1,PEEP為0,吸入氣體為室內(nèi)空氣,潘庫溴胺肌注維持肌肉松弛。股靜脈和頸內(nèi)動脈穿刺置管,監(jiān)測生命體征及補液等。機械通氣達到預(yù)定時間后,放血處死大鼠。小心分離左右兩側(cè)肺組織,左肺行肺灌洗,右側(cè)上葉肺組織石蠟包埋,其余3葉右肺組織直接放入液氮中保存待檢?；厥盏姆喂嘞匆?BALF)一部分行白細(xì)胞計數(shù),另一部分立即離心10 min(2 500 r/min),上清液于-70℃冰箱保存待檢。

1.3 主要測定指標(biāo)及方法

1.3.1 肺組織病理學(xué)觀察 將上述石蠟包埋的肺組織標(biāo)本切片行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)、肺內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤及分類等特征改變。按以下4項指標(biāo)行急性肺損傷(ALI)評分[7],A:肺毛細(xì)血管充血;B:肺內(nèi)出血;C:中性粒細(xì)胞在血管壁肺間隙集聚或浸潤;D:肺泡壁增厚或透明膜形成。每一項按5分制來判斷:0=最輕微損害;1=輕微損害;2=中度損害;3=重度損害;4=最嚴(yán)重?fù)p害。

1.3.2 肺濕干重(W/D)比值測定及中性粒細(xì)胞計數(shù) 取動物一葉右肺組織,稱濕重后置于烤箱中,70℃烘烤至恒重后稱干重,計算肺W/D比值;肺灌洗方法:2 mL生理鹽水緩慢注入左肺,片刻后回抽,反復(fù)3次,然后回收BALF行白細(xì)胞計數(shù)。

1.3.3 總蛋白和髓過氧化物酶(MPO)活性測定

BALF中總蛋白的測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法,采用UV-2000型分光光度計測量吸光度;肺組織MPO活性測定采用MPO試劑盒:準(zhǔn)確稱取液氮保存的大鼠肺組織0.1 g,按重量體積比1∶19加勻漿緩沖液制備成5%組織勻漿,按照試劑盒說明書步驟,分光光度計法測定吸光度,計算出MPO活性。

1.3.4 RT-PCR檢測肺組織中血管緊張素原(AGT)、ACE及AT1mRNA的表達水平 準(zhǔn)確稱取100 mg肺組織,Trizol一步法提取RNA;所得的RNA產(chǎn)物溶于50 μ L DEPC-H2O中,測量樣品在260和280 nm波長下的吸光度值,確定樣品RNA的質(zhì)量和純度;抽取1 μ g總RNA,嚴(yán)格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所提供的方法合成 cDNA;PCR反應(yīng)體系包括 :cDNA 4 μ L,Buffer 5 μ L,dNTP 1 μ L,引物的正義鏈和反義鏈各 1 μ L,MgCl24 μ L,Taq 酶 1 μ L,加水至50 μ L。內(nèi)參照管家基因磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物序列為:5′-TGAAGGTCGGTGTCAACGGAT T TGGC-3′和 5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′,目的基因片段長度為 983 bp;AGT 特異引物 為:5′-CCTCGCTCTCTGGACT TATC-3′和 5′-CAGACACTGAGGTGCT-GTTG-3′,目的基因片段長度為226 bp;ACE特異引物為:5′-GCT TCCCCAACAAGACTGCCA-3′和5′-CCACATGTCTCCCAGCAGATG-3′,目的基因片段長度為 380 bp;AT1特異性引物為:5′-GTAGCCAAAGTCACCTGCAT-3′和 5′-TCAGGCAATTGT TAAAATAAGCTAT-3′,目的 基 因片段長度為463 bp。PCR擴增條件:95℃預(yù)變性。變性:94℃,30 s;退火:55℃,30 s(GAPDH)/60℃,30 s(AGT)/57℃,30 s(AT1);延伸:72℃,30 s(AT1)/72℃,45 s(其他)。72℃延伸,4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,圖像分析軟件(Imagemaster)分析目的基因片段的吸光度值,并計算其與GAPDH值的比值 ,以±s表示。

1.3.5 Western blot法檢測ACE蛋白的含量 少量大鼠右肺組織與液氮混合后碾碎,提取核蛋白;考馬斯亮藍(lán)法定量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳;蛋白轉(zhuǎn)膜后一抗孵育,4℃過夜;室溫下二抗搖床雜交1 h;ECL化學(xué)發(fā)光法檢測陽性信號。采用Bio-Rad Gel Doc1000成像系統(tǒng)采集X線片上的試驗結(jié)果圖像,用圖像分析軟件(Image master)分析圖像條帶,并計算其積分吸光度。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定肺組織中ANGⅡ的水平 取肺組織勻漿,嚴(yán)格按照試劑盒說明操作,在酶標(biāo)儀上測出標(biāo)準(zhǔn)品吸光度并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后根據(jù)測得的樣品吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品的濃度(pg/mL)。

1.3.7 免疫組化法檢測肺組織AT1的表達 采用鏈霉親合素-生物素化過氧化酶復(fù)合物法(SABC法),按照北京中山公司SABC試劑盒操作步驟進行;在400倍光鏡下每張切片隨機觀察10個視野,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核呈棕黃色為陽性;計數(shù)每100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)改變肺損傷評分(ALI評分)

A組肺組織無明顯病理改變,肺泡間隔正常,偶見少量的炎性細(xì)胞及巨噬細(xì)胞,肺泡腔無滲出物;B組肺組織病理改變明顯,肺泡間隔增厚,肺泡腔內(nèi)可見較多的炎性細(xì)胞浸潤;C組肺組織病理改變較B組加重,肺泡間隔明顯增厚,肺泡腔浸潤的炎性細(xì)胞明顯增多,部分肺泡萎陷或破裂;D組肺組織病理改變又較C組加重,肺泡及肺間質(zhì)水腫,部分肺泡隔斷裂、肺泡破裂、相互融合,大量肺泡萎陷且程度不均一。和A組相比,B、C、D組ALI評分均顯著增高(均P＜0.01);和B組比較,C、D兩組 ALI評分顯著增高(均P＜0.05);和C組比較,D組ALI評分也顯著增高(P＜0.05)。見表1。

2.2 肺W/D及肺組織(BALF)中MPO、總蛋白濃度、中性粒細(xì)胞計數(shù)值

和A 組相比,B、C、D 組W/D、MPO、總蛋白濃度、中性粒細(xì)胞計數(shù)值顯著升高(均P＜0.01);和B組相比,C、D組W/D、MPO、總蛋白濃度、中性粒細(xì)胞計數(shù)值亦顯著升高(均P＜0.05);和C組相比,D組W/D、MPO、總蛋白濃度、中性粒細(xì)胞計數(shù)值顯著升高(均P＜0.05)。見表1。

表1 各組肺組織ALI評分、濕干重比值、M PO活性,BALF中總蛋白、白細(xì)胞計數(shù)的比較(±s,n=6)Table 1 Comparison of ALI scores,wet/dry ratios,MPO activity,total protein and neutrophil counts(±s,n=6)

表1 各組肺組織ALI評分、濕干重比值、M PO活性,BALF中總蛋白、白細(xì)胞計數(shù)的比較(±s,n=6)Table 1 Comparison of ALI scores,wet/dry ratios,MPO activity,total protein and neutrophil counts(±s,n=6)

*P＜0.01 vs g roup A;#P＜0.05 vs g roup B;△P＜0.05 vs group C

Groups ALI scores Wet/dry ratios MPO activity(U/g) Total protein(g/L) Neutrophil counts(×104)A 3.04±0.72 4.59±0.67 0.32±0.08 0.24±0.06 22.40±3.20 8.85±1.65* 5.94±0.79* 3.86±0.87* 4.54±0.89* 124.90±27.20*C 11.15±1.93*# 7.14±0.97*# 5.58±1.14*# 6.65±0.67*# 190.80±54.30*#B D 13.23±2.16*#△ 8.16±1.03*#△ 8.15±1.28*#△ 7.82±1.08*#△ 211.10±41.20*#△

2.3 RT-PCR檢測肺組織AGT、ACE、AT1mRNA的表達水平

和A 組比較,B、C、D 組 AGT 、ACE、AT1mRNA的表達水平顯著增高(均P＜0.01);和B組比較,C、D兩組AGT、ACE、AT1mRNA的表達水平顯著增高(均P＜0.05);和C組比較,D組AGT、ACE、AT1mRNA的表達水平顯著增高(均 P＜0.05)。見圖1、表2。

圖1 RT-PCR檢測各組肺組織AGT、ACE、AT1mRNA的表達水平Fig.1 The expressions of AGT,ACE,A T1mRNA in lung tissues of each group detectd by RT-PCR

2.4 Western blot檢測肺組織ACE蛋白的含量

和A組比較,B、C、D組肺組織ACE蛋白的含量顯著增高(均P＜0.01),和B組比較,C、D兩組ACE蛋白的含量顯著增高(均P＜0.05);和C組比較,D組ACE蛋白的含量亦顯著增高(P＜0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western blot檢測各組肺組織ACE蛋白的含量Fig.2 The expressions of ACE protein in lung tissues of each g roup detected by Western blot

2.5 ELISA檢測大鼠肺組織ANGⅡ的含量

和A組比較,B、C、D組肺組織ANG Ⅱ含量顯著增多(均P＜0.01);和B組比較,C、D組ANG Ⅱ水平顯著升高(均 P＜0.05);和C組比較,D組ANG Ⅱ水平亦顯著增高(P＜0.05)。見表2。

2.6 免疫組化法檢測肺組織AT1的表達

A組肺組織肺上皮細(xì)胞AT1僅有微弱的表達,而B、C、D組肺組織肺上皮細(xì)胞AT1表達顯著增多(均 P＜0.05);和B組相比,C、D組 AT1表達水平顯著升高(均P＜0.01);C和D組AT1的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3、表2。

圖3 免疫組化法檢測各組肺組織AT1的表達(SABC染色,×200)Fig.3 T he ex pressions of AT1protein in lung tissues of each group detected by immunohistochemical techniques(SABC staining,×200)

表2 各組肺組織AGT、ACE、AT1mRNA的表達水平、ACE蛋白、ANG Ⅱ的含量及AT1陽性細(xì)胞計數(shù)的比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of the expression of AGT,ACE,AT1mRNA,ACE protein,ANG Ⅱ contents and AT1 positive cell counts(±s,n=6)

表2 各組肺組織AGT、ACE、AT1mRNA的表達水平、ACE蛋白、ANG Ⅱ的含量及AT1陽性細(xì)胞計數(shù)的比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of the expression of AGT,ACE,AT1mRNA,ACE protein,ANG Ⅱ contents and AT1 positive cell counts(±s,n=6)

*P＜0.01 vs g roup A;#P＜0.05 vs g roup B;△P＜0.05 vs group C

Groups AG T mRNA ACE mRNA A T1mRNA ACE protein ANGⅡ(pg/mL) AT1positive cell A 0.15±0.03 0.16±0.04 0.18±0.05 22.03±4.15 115.63±17.25 12.56±3.57 B 0.29±0.06* 0.31±0.06* 0.33±0.07* 49.31±3.56* 223.84±33.51* 30.72±5.36*C 0.45±0.11*# 0.50±0.12*# 0.58±0.13*# 112.48±5.60*# 328.17±49.26*# 56.22±6.49*#D 0.65±0.16*#△ 0.79±0.17*#△ 0.81±0.18*#△ 169.75±8.17*#△ 416.32±56.53*#△ 79.61±8.13*#

3 討論

VILI是肺功能嚴(yán)重受損的患者行機械通氣支持治療時的常見并發(fā)癥,其致病機制非常復(fù)雜,包含急性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多方面的因素,與其他致病因素(如:內(nèi)毒素)所致肺損傷的致病機制略有不同[8-9]。

在本研究中,對照組肺組織病理切片無明顯病理改變,肺組織ALI評分處于較低水平。而B、C、D組肺組織病理切片出現(xiàn)明顯的急性炎性損傷性改變,具體表現(xiàn)為肺間隔明顯增厚、炎性細(xì)胞的浸潤以及肺泡腔中出現(xiàn)滲出物等,且其程度(ALI評分)隨著機械通氣時間的延長而顯著加重。W/D比值和BALF中總蛋白可反映肺水腫的程度;MPO是中性粒細(xì)胞釋放的一種過氧化物酶類,和中性粒細(xì)胞的數(shù)目存在極顯著的相關(guān)性,可反映肺組織中性粒細(xì)胞浸潤的水平。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),和對照組相比,B、C、D 組肺組織 W/D、BALF中MPO 活性、總蛋白濃度、中性粒細(xì)胞計數(shù)值顯著增高。并隨著通氣時間的延長而顯著增加,這些結(jié)果和Karzai等[6]的研究一致,說明我們成功地復(fù)制了大鼠VILI模型。且大鼠肺損傷程度和機械通氣的時間密切相關(guān),大鼠機械通氣4 h時VILI最嚴(yán)重,我們的預(yù)實驗也發(fā)現(xiàn),如果機械通氣時間超過4 h,大鼠死亡率會顯著增高。

近些年來,RAS在炎癥反應(yīng)、急性肺損傷中的作用逐漸受到關(guān)注。RAS不只存在于心血管系統(tǒng),研究表明,在人和大鼠肺組織中,也存在局部RAS,并對肺組織細(xì)胞的生長、凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用,其中尤以ANGⅡ及AT1較為關(guān)鍵。ANG Ⅱ最初是作為一種具有血管收縮作用的多肽被發(fā)現(xiàn),近些年來發(fā)現(xiàn)ANGⅡ及其受體廣泛參與了機體的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多方面的作用,具有較為廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。研究證明,ANGⅡ通過激活A(yù)T1,能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞內(nèi)多種和炎癥密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如p38MAPK、JNKs等)的激活[10-11]。細(xì)胞和動物實驗證明,ANGⅡ通過激活A(yù)T1可使多種細(xì)胞間黏附分子、炎性細(xì)胞因子、趨化因子的表達顯著增高,提示ANG Ⅱ可能在炎癥反應(yīng)的機制中起著重要的作用[12-13]。正因為RAS在急性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡中起著多方面的作用,RAS在急性肺損傷致病機制中的作用才逐漸受到重視。

在本研究結(jié)果中:和對照組相比,B、C、D組肺組織AGT、ACE、AT1mRNA 的表達水平、ACE及ANG Ⅱ的含量顯著增高(均P＜0.01),且上述各指標(biāo)可隨著通氣時間的延長而顯著增加。結(jié)果說明大鼠大潮氣量機械通氣在產(chǎn)生了明顯VILI的同時,也顯著激活了RAS;我們同時發(fā)現(xiàn):對照組肺組織肺上皮細(xì)胞AT1僅有較微弱的表達,而B、C、D組肺組織肺上皮細(xì)胞 AT1表達顯著增多(均 P＜0.05);和B組相比,C、D組AT1表達水平顯著升高(均P＜0.05);可能是VILI激活了RAS后誘導(dǎo)大鼠肺組織AGT、ACE、ANG Ⅱ及AT1的表達顯著增加,這可能是VILI的致病機制之一,但其具體作用機制還需更進一步研究。

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