周 婷 王世宣 翁丹卉 盧運萍 馬 丁

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦產科,武漢 430030

RNA干擾(RNAi)是運用雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的轉錄后水平基因沉默機制[1],能特異性抑制靶基因轉錄,進而下調相應蛋白表達水平及功能。新近的RNAi技術是利用DNA載體直接在體內表達發(fā)卡狀的siRNA(shRNA),特異性封閉相應的靶mRNA,抑制mRNA的翻譯。與早期的RNA干擾技術相比,該方法的特異性和干擾效率均有較大提高,已廣泛應用于各種研究領域。紫杉醇類化療藥物泰素作為全球第一種被確證的微管穩(wěn)定藥物,在實體瘤的治療方面取得了巨大成功,但臨床上耐藥病例仍頻繁發(fā)生[2]。紫杉醇通過抑制微管解聚進而阻滯細胞周期殺傷腫瘤,有研究提示這種殺傷作用有賴于具有完整功能的紡錘體檢查點。紡錘體檢查點是細胞周期的最后關卡[3]。紡錘體檢查點功能低下時有發(fā)生,而這種功能低下與某些紡錘體蛋白的低表達有關。Bub1作為紡錘體檢查點的平臺蛋白,在維持紡錘體檢查點的穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮了重要作用。目前紡錘體檢查點功能是國際分子生物學研究的一個熱點,但國內在該領域的研究甚少,本研究旨在運用RNAi技術,特異、穩(wěn)定地抑制卵巢癌細胞Bub1 mRNA及蛋白水平表達,以對其在卵巢癌細胞紫杉醇化療過程中的功能進行初步研究,并為進一步的機制探討打下良好基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

pEGFP-C1空質粒為本室保存;轉染試劑Lipo 2000TM購自Invitrogen公司;質粒提取試劑盒購自博大泰克,凝膠回收試劑盒購自Gibco公司;限制性內切酶購自TaKaRa公司;T4DNA連接酶購自NEB公司;四甲基偶氮唑鹽(MT T)、二甲亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)及紫杉醇購自德國Sigma公司,PCR引物由上海生工公司合成?？谷薆ub1單克隆鼠抗購自Chemicon公司,辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 人pEGFP-Bub1-shRNA真核表達載體的構建及酶切鑒定

根據GenBank提供的Bub1基因序列,使用美國Ambio公司在線設計軟件,通過基因序列比對,挑選出3條特異性寡核苷酸序列:序列1(GAGTGATCACGATT TCTAA)、序 列 2(CCAUGGGAUUGGAACCCUGTT)及序列 3(CCAGGCUGAACCCAGAGAGT T),合成相應的shRNA正義鏈及其互補鏈。以 RNAi-Ready pSI-RENDNR-DsRed-Express Vector質粒為模板,采用PCR方法擴增出帶有U6啟動子和shRNA序列的表達框,測序后分別用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切,插入同樣以EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切的pEGFP-C1質粒,瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化酶切產物,后者與合成序列以T4連接酶連接3 h,轉化入大腸埃希菌DH5α。篩選可疑重組陽性菌株,250 r/min搖菌過夜,小提質粒后用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,鑒定正確者送Invitrogen公司測序,測序正確者保種,將獲得的人 Bub1重組質粒命名為 pEGFPBub1-shRNA,大量提取質粒進行下一步的細胞轉染。

1.3 細胞培養(yǎng)、轉染與穩(wěn)定篩選

人卵巢癌SKOV3細胞系購自ATCC,細胞以體積分數為10%FBS的McCoy's 5a培養(yǎng),37℃,5%CO2,常規(guī)消化傳代。3×105個/孔接種 6孔板,待細胞密度達到50%～60%時轉染細胞,每孔加入8 μ L脂質體和 4.0 μ g質粒,同時設立空質粒對照組及空白對照組。48 h后加入濃度為500 mg/L的G418進行篩選,待對照細胞死亡殆盡時改用維持濃度200 mg/L,2周后挑取穩(wěn)定的克隆進行鑒定,具有明顯沉默效應者轉入培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測各組細胞中Bub1基因mRNA水平的表達

收集轉染48 h的各組細胞,Trizol試劑一步法提取細胞總RNA,以M-MLA逆轉錄酶進行逆轉錄,PCR擴增,同時擴增GAPDH作為內參照,以檢查Bub1在轉錄水平的表達情況。Bub1引物序列:上 游 引物 5′-TAAACCCACAGGAGCCAGGAC-3′;下游引物 5′-CAAGCCTCAACGCCCAACT-3′;擴增條件為:95℃預變性5 min;95℃30 s,56.5℃45 s,72℃30 s,29個循環(huán);72℃延伸10 min。GAPDH 引物 :上游引物:5′-ACGGATT TGGTCGTATTGGG-3′;下 游 引物 :5′-TGAT TT TGGAGGGATCTCGC-3′;擴增條件為:95℃預變性 5 min;95℃30 s,54℃45 s,72℃30 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外燈下觀察并拍照,每個樣本至少重復3次。

1.5 Western blot檢測各組細胞中Bub1蛋白水平的表達

轉染48 h后收集細胞,提取總蛋白,40 μ g蛋白行SDS-PAGE電泳,將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶室溫封閉2 h,一抗4℃孵育過夜,用含0.05%Tween 20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次,每次10 min;加入相應的堿性磷酸酶標記的二抗(1∶1 000),37℃孵育1 h,用顯色底物NBT/BCIP/buffer(1∶1∶250)顯色,以等量β-actin蛋白質作為對照,每個樣本至少重復3次。

1.6 MTT法測定各組細胞對紫杉醇的敏感性

將經過穩(wěn)定篩選、擴大培養(yǎng)后的各組細胞,胰酶消化后制成單細胞懸液,調整細胞密度為8×103/孔接種于96孔板,待細胞貼壁后以含不同濃度(30、90、300、1 000 nmol/L)紫杉醇的MaCoy'5a培養(yǎng)液200 μ L進行處理,每一濃度設3個復孔,并設不加藥物和不加細胞的空白以及陰性對照組,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加1 mg/mL MT T 溶液100 μ L 作用4 h,棄上清液,每孔加入 DMSO 150 μ L,振蕩使其充分溶解,在96孔板酶標儀上測定波長為570 nm的吸光度值(A),按如下公式計算細胞生長抑制率:細胞生長抑制率(%)=1-(實驗孔A/不加藥物孔A)×

100%。

1.7 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率

收集經紫杉醇(1 μ mol/L)作用24及 48 h的轉染前后各組細胞,以冷PBS洗滌之,70%乙醇于-20℃固定過夜,洗滌,離心1 500 r/min,5 min,后加入含有 10 μ g/mL PI和0.1%RNase A 的 PBS液500 μ L,室溫避光染色30 min后上流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.8 圖像分析

RT-PCR和Western blot結果經Uvp grabit Image1軟件采集,Gelworks 1D Advanced V4.01軟件處理分析,計算條帶的積分吸光度(IA),采用目的條帶與GAPDH的IA比值表示待測樣本的含量。

1.9 統計學處理

運用SPSS 12.0軟件對實驗數據進行統計學分析,各實驗結果以±s表示,差異顯著性檢驗采用非參數檢驗和方差分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 質粒酶切、鑒定及測序

將合成的3段退火片段分別與線性載體連接、轉化后,分別挑取3～4個克隆,經擴增,提取質粒DNA,雙酶切鑒定及測序,確定其中的6個克隆(2、4、5、7、11及12號克隆)插入一段大約360 bp的片段(含1個U6啟動子),測序證實插入片段完全正確(圖1)。

圖1 人真核表達質粒pEGFP-Bub1-shRNA的酶切鑒定Fig.1 Identification of the human recombinant plasmid pEGFP-Bub1-shRNA

2.2 穩(wěn)定篩選

將得到2號(序列3)、7號(序列 2)及12號(序列1)克隆進行質粒的大量提取,無菌化處理質粒后轉染SKOV3細胞,G418加壓篩選2周后可見有細胞克隆形成,倒置熒光顯微鏡下觀察克隆中95%以上的細胞可見較強的綠色熒光(圖2),挑取克隆進行擴大培養(yǎng)。

圖2 pEGFP-C1和pEGFP-Bub1-shRNA轉染SKOV3細胞G418篩選后穩(wěn)定表達(×40)Fig.2 The green fluorescence in SKOV3 cells observed under the fluorescent microscope after transfected with plasmids(×40)

2.3 各組細胞中Bub1 mRNA的表達

凝膠電泳分析各組細胞Bub1 mRNA表達的差異,由圖3可見,pEGFP-C1/SKOV3組和SKOV3組細胞約450 bp處條帶清晰明亮,7號及12號克隆所對應的pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3在同樣位置出現模糊條帶,而2號克隆與對照組相比無明顯差異。經相對強度對比分析,7號及12號克隆相對表達強度分別為(0.25±0.05)和(0.18±0.03),pEGFP-C1/SKOV3組為(0.70±0.08),7號及12號克隆與pEGFP-C1/SKOV3組相比差異均有顯著性意義(P＜0.05),12號克隆的干擾效應強于7號克隆。以上結果說明,序列1對應的pEGFP-Bub1-shRNA質粒的干擾效應在三者中最強,后續(xù)實驗均以該質粒為基礎進行。

圖3 各組細胞中Bub1 mRNA的表達Fig.3 Bub1 mRNA expression in cells of each group

2.4 各組細胞蛋白質水平的表達

由圖4可見,pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3細胞Bub1蛋白相對表達強度(Bub1/β-actin)為(0.10±0.04),而 pEGFP-C1/SKOV3和 SKOV3細胞Bub1蛋白相對表達強度分別為(0.80±0.03)和(0.78±0.04),以上結果說明,pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3細胞Bub1蛋白表達水平較 pEGFPC1/SKOV3和SKOV3兩組細胞明顯降低,差異具有統計學意義(P＜0.05)。

圖4 各組中Bub1蛋白的表達Fig.4 Bub1 protein expression in cells of each group

2.5 各組SK OV3細胞紫杉醇敏感性

如圖5所示,紫杉醇濃度為 90、300及1 000 nmol/L時,pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3組細胞的生長抑制率顯著低于pEGFP-C1/SKOV3和SKOV3細胞,差異均具有統計學意義(P＜0.05);由表1可以看到,以1 μ mol/L紫杉醇作用 24及 48 h,pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3組細胞的凋亡率顯著低于pEGFP-C1/SKOV3組,差異具有統計學意義(P＜0.01);pEGFP-C1/SKOV3和 SKOV3細胞的生長抑制率和凋亡率相比差異均無統計學意義。

圖5 各組細胞的生長抑制率Fig.5 The inhibition rate of proliferation in each group

表1 1μ mol/L紫杉醇處理后不同時間點各組細胞凋亡率(±s,%)Table 1 The apoptosis rate of cells treated with paclitaxel at different time points in each g roup(±s,%)

表1 1μ mol/L紫杉醇處理后不同時間點各組細胞凋亡率(±s,%)Table 1 The apoptosis rate of cells treated with paclitaxel at different time points in each g roup(±s,%)

*P＜0.01 vs pEGFP-C1/SKOV3 group

Groups 0 h 24 h 48 h SKOV3 1.63±0.35 10.14±1.73 34.17±3.22 pEGFP-C1/SKOV3 2.43±0.42 12.15±1.97 37.22±3.88 pEGFP-Bub1-shRNA/SKOV3 2.20±0.27 4.42±0.62*12.98±1.94*

3 討論

RNAi現象自1998年被發(fā)現以來,已逐步成為腫瘤相關基因領域的研究熱點。從小分子干擾RNA技術到shRNA技術,RNAi技術在穩(wěn)定性和臨床應用潛能上得到了深入發(fā)展[4]。siRNA干擾效果不穩(wěn)定,在哺乳動物中時效性差,且siRNA在細胞內容易被降解,對 RNase-free環(huán)境要求高,與siRNA技術相比,shRNA技術既保持了siRNA特異性高的優(yōu)勢,且其具有更強的穩(wěn)定性,能夠持續(xù)發(fā)揮抑制作用以便研究者在更長的時間跨度中對基因功能進行深入探索。本研究構建的shRNA真核表達質粒pEGFP-Bub1-shRNA轉染人卵巢癌細胞SKOV3后,該細胞內Bub1 mRNA及蛋白表達水平明顯下調,證實構建的pEGFP-Bub1-shRNA真核表達質粒能高效阻斷Bub1基因表達,為進一步研究Bub1基因的生物學功能提供了有力工具。

細胞在長期的進化過程中產生的監(jiān)控紡錘體形態(tài)、染色體著絲點與微管聯接及其產生的張力、染色體排列、確保姐妹染色單體精確分離的質控機制,即紡錘體檢查點,又稱有絲分裂檢查點[5]。蛋白激酶Bub1作為紡錘體檢查點的平臺蛋白,可能是紡錘體檢查點其他組分定位于紡錘體檢查點的基礎。Bub1可通過直接作用及形成復合物的形式來調控其他重要的紡錘體檢查點蛋白,如Bub3、Mad2及CDC20等,進而影響細胞周期的進程[6]。雖然臨床大樣本的研究提示紡錘體檢查點基因突變頻率極低,但多種腫瘤細胞確實存在紡錘體檢查點功能缺陷,而有研究表明這種缺陷可能與紡錘體檢查點蛋白表達異常有關。有文獻報道急性髓細胞白血病細胞中存在Bub1 mRNA低表達[7];Shichiri及其研究小組[8]發(fā)現大腸癌組織Bub1整體表達水平明顯高于鄰近正常組織,與此同時,少數Bub1 mRNA表達水平明顯低于正常組織的大腸癌似乎更易于發(fā)生淋巴結轉移和復發(fā);此外,有研究發(fā)現,胃癌組織Bub1 mRNA顯著高表達,且與癌細胞增殖相關[9]。早在提出“紡錘體檢查點”概念前,微管穩(wěn)定劑之一的紫杉醇類藥物就已廣泛應用于臨床,它們的主要作用靶點就是紡錘體檢查點。雖然這類藥物在臨床應用上取得了巨大成功,但耐藥現象仍時有發(fā)生。相關研究指出紫杉醇類藥物的敏感性必須依賴于功能完整的紡錘體檢查點[10],因此,若想提高這些抗癌藥物的效能,就必須對紡錘體檢查點蛋白的功能進行更為深入的研究。目前,該領域的研究是國際癌癥研究的熱點之一,國內研究尚處于起步階段,文獻報道極少。

我們運用RNAi技術在轉錄后水平特異性干擾SKOV3細胞中Bub1 mRNA的表達,進而降低了Bub1蛋白表達水平,隨后經紫杉醇處理,發(fā)現腫瘤細胞生長抑制率顯著下降,凋亡細胞明顯減少,由此初步證明Bub1在卵巢癌細胞化療耐藥中發(fā)揮了重要作用。有研究者推測紡錘體檢查點功能缺陷的細胞在紡錘體抑制因子持續(xù)或高劑量作用后,可不停滯于過渡期而變?yōu)槎啾扼w細胞,繼續(xù)存活;正常細胞則長期停滯于該期,因紡錘體未及時修復而發(fā)生凋亡。我們在SKOV3細胞模型中的實驗結果為上述研究提供了佐證。盡管如此,Bub1表達低下時哪些關鍵下游基因隨之變化,Bub1基因的下調是否直接影響紡錘體檢查點的功能,紡錘體檢查點的失活是否導致腫瘤細胞化療耐藥,這些問題還有待于深入探討。值得注意的是,在不同的細胞系,紡錘體檢查點的功能呈現多元化的趨勢,例如,我們的前期研究提示,在某些宮頸癌細胞株中,通過蛋白抑制劑破壞其紡錘體檢查點蛋白Bub1可增強紫杉醇的殺滅效能,故在這類細胞中運用pEGFP-Bub1-shRNA載體抑制Bub1的表達亦可能增強宮頸癌輔助化療的敏感性。綜上所述,深入了解紡錘體檢查點蛋白功能對于探討紡錘體檢查點的作用機制和提高腫瘤細胞化療療效均具有十分重要的意義,而我們前期的相關工作為后續(xù)研究奠定了良好的基礎。

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