熊 俊 宋自芳

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院肝膽外科,武漢 430022

小腸組織富含淋巴細(xì)胞,腸黏膜上皮大量表達(dá)主要組織相容性抗原,導(dǎo)致小腸移植術(shù)后極易發(fā)生嚴(yán)重的排斥反應(yīng),且一般的免疫抑制藥物難以控制,這也是臨床開(kāi)展小腸移植的主要障礙[1]。本研究通過(guò)門(mén)靜脈途徑輸注適量的供體骨髓細(xì)胞,制造混合嵌合體,觀察大鼠小腸移植排斥反應(yīng),并分析其細(xì)胞因子的改變與病理學(xué)改變之間的關(guān)系,為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物系北京醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供的近交系健康清潔級(jí)雄性BN大鼠30只,雌性Lewis大鼠30只,體重260～300 g,飼養(yǎng)條件符合SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)分3組:①對(duì)照組:BNLewis組(n=10),異位小腸移植受體Lewis雌性大鼠;②FK506組:BN-Lewis+FK506組(n=10),異位小腸移植受體Lewis雌性大鼠+口服FK506;③PV組:BN-Lewis+BM(P.V.injection)+FK506組(n=10),異位小腸移植受體Lewis雌性大鼠+經(jīng)門(mén)靜脈注入供體BN雄性大鼠的骨髓細(xì)胞+口服FK506。上述分組中,BN雄性大鼠為異位小腸移植物的供體來(lái)源,Lewis雌性大鼠為異位小腸移植的受體。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 FK506,商品名為普樂(lè)可復(fù),臨床常用免疫抑制劑,購(gòu)自日本藤澤公司。IL-2、IL-10的 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó) BioSource公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠異位節(jié)段小腸移植模型的制備 采用腸系膜上動(dòng)脈-腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合以及門(mén)靜脈-左腎靜脈套管吻合重建供腸血管,遠(yuǎn)端腸管腹壁造瘺,制備小腸移植動(dòng)物模型[2]。

1.2.2 供體骨髓細(xì)胞的提取、體外處理及受體體內(nèi)注入 ①供體骨髓細(xì)胞的提取:提取供體骨髓細(xì)胞,將其調(diào)整為2.5×108個(gè)/mL。操作結(jié)束將細(xì)胞懸液置于4℃冰箱。②骨髓細(xì)胞活性檢測(cè):用錐蟲(chóng)藍(lán)染色3 min后,直接在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù),確?；钚约?xì)胞的比例大于95%。③向受體Lewis雌性大鼠注入供體BN雄性大鼠的骨髓細(xì)胞:受體小腸移植完畢關(guān)腹前,取1 mL骨髓細(xì)胞懸液(約2.5×108個(gè)細(xì)胞),經(jīng)門(mén)靜脈緩慢注入受體大鼠體內(nèi)。

1.2.3 異位小腸移植受體 Lewis雌性大鼠的FK506喂服 術(shù)后0～5 d按1 mg/(kg·d)經(jīng)口灌服FK506懸液。

1.2.4 測(cè)定各組異位小腸移植受體Lewis雌性大鼠術(shù)后生存時(shí)間 分別測(cè)定對(duì)照組,FK506組,PV組受體大鼠存活時(shí)間。

1.2.5 各時(shí)間段移植供腸的排斥反應(yīng)檢測(cè)及評(píng)分各實(shí)驗(yàn)組分別于術(shù)后第7、14、30天及實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)間用乙醚麻醉受體大鼠,通過(guò)腹部造瘺口切除0.5 cm的移植腸管,固定、切片,進(jìn)行移植供腸蘇木精-伊紅染色。參照Schaefer等[3]的小腸移植排斥反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分:0分為無(wú)排斥反應(yīng),1分為輕度急性排斥反應(yīng),2分為中度急性排斥反應(yīng),3分為重度急性排斥反應(yīng),4分為慢性排斥反應(yīng)。

1.2.6 ELISA法測(cè)定血清 IL-2、IL-10水平ELISA法測(cè)定異位小腸移植受體雌性 Lewis大鼠不同時(shí)間段血清中IL-2、IL-10的含量,具體檢測(cè)操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有資料建成數(shù)據(jù)庫(kù),采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析,用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異位節(jié)段性小腸移植受體Lewis雌性大鼠生存時(shí)間分析

各實(shí)驗(yàn)組小腸移植受體Lewis雌性大鼠生存時(shí)間分析顯示,與對(duì)照組(76 d)、FK506組(81 d)相比,PV組(121 d)受體大鼠存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)異位節(jié)段小腸移植受體Lewis雌性大鼠移植小腸病理變化及排斥反應(yīng)評(píng)分

術(shù)后第7天(圖1A),對(duì)照組腹壁造瘺口外觀無(wú)水腫,黏膜血運(yùn)良好,組織病理學(xué)蘇木精-伊紅染色顯示黏膜下較多單核細(xì)胞侵潤(rùn),少量黏膜上皮細(xì)胞脫落。重度急性排斥現(xiàn)象在術(shù)后第14天可觀察到,造瘺口黏膜水腫明顯,分泌物減少,光鏡下(圖1B)小腸黏膜絨毛增粗、部分黏膜破壞嚴(yán)重伴潰瘍形成,血管周?chē)写罅繂魏思?xì)胞侵潤(rùn)。術(shù)后第30天對(duì)照組實(shí)驗(yàn)大鼠可見(jiàn)到慢性排斥反應(yīng)現(xiàn)象,造瘺口腸壁增厚、光澤消失、分泌物少且黏稠,光鏡下(圖1C)小腸黏膜明顯萎縮,絨毛平坦,黏膜下見(jiàn)纖維組織增生,可見(jiàn)閉塞的血管。死亡后解剖發(fā)現(xiàn):移植小腸明顯擴(kuò)張,管腔內(nèi)有大量黏稠的內(nèi)容物無(wú)法排出并壓迫正常小腸,供腸管壁增厚質(zhì)硬,失去柔韌感,呈鉛管樣改變。與對(duì)照組相比較,FK506組嚴(yán)重急性排斥反應(yīng)的時(shí)間推遲至術(shù)后30 d,黏膜的破壞程度也沒(méi)有對(duì)照組嚴(yán)重(圖1D)。而PV組術(shù)后第30天小腸黏膜基本完好(圖1E),少數(shù)幾只實(shí)驗(yàn)大鼠可見(jiàn)輕、中度排斥反應(yīng)。術(shù)后3個(gè)月,PV組移植小腸也可見(jiàn)不同程度的擴(kuò)張,腸壁增厚僵硬,絨毛低平,黏膜下可見(jiàn)明顯的纖維組織增生(圖1F)。對(duì)小腸移植受體Lewis雌性大鼠不同時(shí)間段排斥反應(yīng)評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 受體大鼠移植小腸病理變化(蘇木精-伊紅染色,×400)Fig.1 Histopathological change of recipient's bowel(HE,×400)

表1 異位節(jié)段性小腸移植Lewis雌性大鼠不同時(shí)間段排斥反應(yīng)評(píng)分(±s,n=10)Table 1 Scores of acute rejection of recipients following heterotopic small bowel transplantation(±s,n=10)

表1 異位節(jié)段性小腸移植Lewis雌性大鼠不同時(shí)間段排斥反應(yīng)評(píng)分(±s,n=10)Table 1 Scores of acute rejection of recipients following heterotopic small bowel transplantation(±s,n=10)

*P＜0.01 vs control g roup;△P＜0.01 vs FK506 group

Groups 7 d 14 d 30 d Control 0.40±0.00 2.40±0.55 3.60±0.55 FK506 0.20±0.45* 1.20±0.45* 3.00±0.71*PV 0* 0.20±0.45*△ 0.60±0.89*△

2.3 異位小腸移植受體雌性Lewis大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-2的含量

各組移植后受體大鼠血清IL-2濃度均增加,但PV組的IL-2增高幅度明顯低于對(duì)照組和FK506組(P＜0.01),見(jiàn)表2。

2.4 異位小腸移植受體雌性Lewis大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-10的含量

各組移植后受體大鼠血清IL-10濃度也均增加,但 PV組 IL-10升高幅度明顯大于對(duì)照組和FK506組(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

表2 異位小腸移植 Lewis雌性大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-2水平(pg/mL,±s,n=10)Table 2 Serum IL-2(pg/mL)levels of recipients following heterotopic small bowel transplantation(±s,n=10)

表2 異位小腸移植 Lewis雌性大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-2水平(pg/mL,±s,n=10)Table 2 Serum IL-2(pg/mL)levels of recipients following heterotopic small bowel transplantation(±s,n=10)

*P＜0.01 vs control g roup;△P＜0.01 vs FK506 group

Groups 0 d 7 d 14 d 21 d 30 d Control 36.12±2.85 72.00±5.32 96.61±4.10 85.04±0.81 68.72±1.87 FK506 36.12±2.85 50.30±7.12* 71.36±0.74* 79.08±7.48* 76.62±4.72*PV 36.12±2.85 41.13±2.93*△ 53.21±2.85*△ 54.19±0.51*△ 55.87±3.20*△

3 討論

小腸移植是治療終末期小腸功能衰竭的最后手段,但由于小腸生理結(jié)構(gòu)的特殊性,導(dǎo)致術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生率極高,急性排斥反應(yīng)發(fā)生率高達(dá)90%,移植后9個(gè)月仍有1/3的患者發(fā)生排斥反應(yīng),慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生率也高達(dá)30%～50%,嚴(yán)重制約了小腸移植的臨床應(yīng)用[3-5]。雖然近年來(lái)免疫抑制藥物的快速發(fā)展使小腸移植排斥反應(yīng)有所緩解,但總體情況仍不容樂(lè)觀。由于免疫抑制藥對(duì)受體免疫系統(tǒng)多為非選擇性的廣泛抑制,常導(dǎo)致受體出現(xiàn)多種并發(fā)癥,比如感染、腫瘤、淋巴細(xì)胞增生紊亂等[6]。

表3 異位小腸移植 Lewis雌性大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-10水平(pg/mL,±s,n=10)Table 3 Serum IL-10(pg/mL)levels of recipients following heterotopic small bowel transplantation(±s,n=10)

表3 異位小腸移植 Lewis雌性大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-10水平(pg/mL,±s,n=10)Table 3 Serum IL-10(pg/mL)levels of recipients following heterotopic small bowel transplantation(±s,n=10)

*P＜0.01 vs control g roup;△P＜0.01 vs FK506 group

Groups 0 d 7 d 14 d 21 d 30 d Control 20.02±0.14 27.00±0.44 26.76±0.28 25.94±0.38 26.05±0.58 FK506 20.02±0.14 32.80±0.48* 29.05±0.18* 28.56±0.43* 27.73±0.25*PV 20.02±0.14 36.31±0.49*△ 40.05±0.32*△ 39.46±0.57*△ 39.25±0.41*△

因此,如何成功地誘導(dǎo)移植物產(chǎn)生特異性免疫耐受,同時(shí)將免疫抑制藥物的毒副作用降至最低是當(dāng)前小腸移植所面臨的重要挑戰(zhàn)[7]。

本研究通過(guò)使用MHC完全不同的成年BN雄性大鼠作為供體、Lewis雌性大鼠作為受體建立同種異位節(jié)段性小腸移植模型,同時(shí)輸注供體骨髓細(xì)胞造成混合嵌合體,依據(jù)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)受體體內(nèi)Y染色體特異性序列Sry基因含量的方法,探討了嵌合體與小腸移植免疫耐受的關(guān)系[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,對(duì)照組Lewis雌性大鼠術(shù)后發(fā)生嚴(yán)重的急性排斥反應(yīng),腹腔內(nèi)移植段小腸呈慢性腸梗阻表現(xiàn),腸腔極度擴(kuò)張,大量黃色非常黏稠的分泌物瘀積;腸管管壁呈鉛管樣改變,質(zhì)硬伴纖維增生明顯;光鏡下黏膜皺褶變平,小腸絨毛消失,固有層大量纖維組織及肉芽組織增生。而骨髓細(xì)胞輸注組(PV組)術(shù)后恢復(fù)較快,供腸造瘺口的腸壁柔軟,有光澤,小腸黏液分泌正常。病理檢查結(jié)果也證實(shí)無(wú)明顯的急性排斥反應(yīng)發(fā)生。并且PV組的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組及 FK506組(P＜0.01)。綜上所述,提示通過(guò)骨髓細(xì)胞輸注可能造成混合嵌合體狀態(tài),可減少或消除小腸移植的急性排斥反應(yīng),延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間,但與慢性排斥反應(yīng)[9]的相關(guān)性還需進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比較,FK506可降低受體體內(nèi)IL-2的濃度,延緩急性排斥反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間,但在生存時(shí)間上未見(jiàn)明顯的延長(zhǎng),與以往的報(bào)道不同[10]。探討其可能原因如下:①本實(shí)驗(yàn)所采用的FK506是口服制劑,受到不同個(gè)體胃腸道吸收率影響,可能直接造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。②本實(shí)驗(yàn)給予受體的FK506的劑量是1mg/(kg·d),分別在術(shù)后0～5 d給予灌服,這種方案免疫抑制藥維持的時(shí)間相對(duì)較短,可能尚無(wú)法達(dá)到顯效的治療藥物濃度,今后將通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)按不同劑量、不同維持時(shí)間加以分層研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,對(duì)照組移植術(shù)后第7天受體血清IL-2的濃度急劇增高,第14天達(dá)到最高峰[(96.61±4.10)pg/mL]。而血清中IL-10濃度術(shù)后只出現(xiàn)輕度平緩的升高。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)受體血清中IL-2濃度變化趨勢(shì)與供腸黏膜的蘇木精-伊紅染色觀察結(jié)果相平行,隨著急性排斥反應(yīng)的發(fā)生,血清中IL-2水平急劇升高,IL-10濃度卻未見(jiàn)明顯變化。而骨髓細(xì)胞輸注組(PV組)正相反,移植術(shù)后14 d開(kāi)始,血清中IL-10的濃度一直維持很高的水平,而在移植術(shù)后30 d內(nèi),血清中IL-2濃度卻僅輕度升高,供腸病理活檢也缺乏急性排斥反應(yīng)發(fā)生的證據(jù)。由此可見(jiàn):對(duì)照組血清中IL-2濃度升高相對(duì)IL-10濃度的變化更加顯著,Th1細(xì)胞的功能明顯增強(qiáng),Th1/T h2的平衡向Th1細(xì)胞方向傾斜,導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。而在骨髓細(xì)胞輸注組(PV組),在同樣的時(shí)間點(diǎn)受體血清中 IL-10濃度升高相對(duì)于IL-2濃度的變化更加顯著,Th1/Th2的平衡向Th2細(xì)胞方向傾斜,導(dǎo)致免疫耐受的發(fā)生[11]。

與臨床肝移植不同的是,肝移植術(shù)后通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶的變化就能及時(shí)地發(fā)現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的發(fā)生,臨床上小腸移植急性排斥的診斷還主要依靠病理檢查,缺乏相關(guān)靈敏的血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行早期診斷。而且由于臨床上不可能如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)菢与S時(shí)手術(shù)切取腸管進(jìn)行病理活檢,僅靠在內(nèi)鏡下取得的少量小腸黏膜組織來(lái)診斷急性排斥反應(yīng),其診斷的陽(yáng)性率則更低。因此,當(dāng)病理組織切片診斷為排斥反應(yīng)時(shí),大多已經(jīng)失去最佳的治療時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,從術(shù)后第7天開(kāi)始,對(duì)照組受體血清中IL-2濃度就已經(jīng)成倍上升,IL-10濃度基本恒定,而病理上的典型表現(xiàn)則需要推遲到第14天,甚至要到第21天才能出現(xiàn)。同樣,FK506組急性排斥反應(yīng)病理診斷亦需到術(shù)后第30天左右才出現(xiàn),而其血清中IL-2的濃度于術(shù)后第14天就已經(jīng)明顯升高,IL-10的濃度反而輕度下降。相反,在骨髓細(xì)胞輸注組中,血清IL-2水平一直沒(méi)有太大的變化,反而IL-10水平明顯升高,與此相平行,術(shù)后30天內(nèi)病理組織切片檢查也未發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)的證據(jù)。由此可見(jiàn):急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)血清中IL-2變化明顯早于組織病理的變化。因此,在臨床上是否可嘗試將受體外周血清IL-2、IL-10濃度共同測(cè)定作為監(jiān)測(cè)小腸移植術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生以及調(diào)整免疫抑制藥物劑量的依據(jù)[3,12-13],有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了骨髓細(xì)胞經(jīng)門(mén)靜脈輸注能明顯延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間,外周血清IL-2、IL-10濃度變化與小腸移植后急性排斥反應(yīng)相關(guān)。

[1] Cobianchi L,Zonta S,Vigano J,et al.Experimental small bowel transplantation from non-heart-beating donors:a largeanimal study[J].Transplant Proc,2009,41(1):55-56.

[2] 游燊,何曉順,熊俊,等.成功建立大鼠異位節(jié)段小腸移植模型細(xì)節(jié)分析[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2007,24(11):1430-1432.

[3] Schaefer N,Tahara K,Websky M V,et al.Acute rejection and the muscularis propria after intestinal transplantation:the alloresponse,inflammation,and smooth muscle function[J].Transplantation,2008,85(10):1465-1475.

[4] Giovanelli M,Gupte G L,Sharif K,et al.Chronic rejection after combined liver and small bowel transplantation in a child with chronic intestinal pseudo-obstruction:a case report[J].Transplant Proc,2008,40(5):1763-1767.

[5] Li M,Ji G,Feng F,et al.Living-related small bowel transplantation for three patients with short gut syndrome[J].Transplant Proc,2008,40(10):3629-3633.

[6] Schaefer N,Tahara K,Pech T,et al.Inducible nitric oxide synthase ex pression in the intestinal muscularis mediates severe smooth muscle dysfunction during acute rejection in allogenic rodent small bowel transplantation[J].J Surg Res,2008,150(2):159-168.

[7] Starzl T E.Immunosuppressive therapy and tolerance of organ allografts[J].N Engl J M ed,2008,358(4):407-411.

[8] 熊俊,舒曉剛.輸注供體骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠小腸移植基因嵌合的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2009,26(10):1343-1345.

[9] 宋自芳,鄭啟昌,李偉,等.骨髓細(xì)胞參與移植物動(dòng)脈硬化的作用研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2007,36(5):620-624.

[10] Mitsuoka N,Iwagaki H,Ozaki M,et al.T he impact of portal infusion with dono r-derived bone marrow cells and intracellular cy tokine expression of graft-infiltrating lymphocytes on the g raft survival in rat small bowel transplant model[J].T ranspl Immunol,2004,13(3):155-160.

[11] Hubbard V M,Eng J M,Ramirez-Montagut T,et al.Absence of inducible costimulator on alloreactive T cells reduces g raft versus host disease and induces T h2 deviation[J].Blood,2005,106(9):3285-3292.

[12] Spahn T W,Ross M,von Eiff C,et al.CD4+T cells transfer resistance against citrobacter rodentium-induced infectious colitis by induction of T h1 immunity[J].Scand J Immunol,2008,67(3):238-244.

[13] Schaefer N,Tahara K,von Websky M,et al.Role of resident macrophages in the immunologic response and smooth muscle dysfunction during acute allograft rejection after intestinal transplantation[J].Transpl Int,2008,21(8):778-791.