盧小嵐，楊華，鄧翔，劉雅，李曉輝，張海港（第三軍醫(yī)大學藥學院藥劑學教研室暨新藥研究中心，重慶市 400038）

心肌肥大是高血壓、冠心病、瓣膜病及先天性心臟病等多種心血管疾病的常見并發(fā)癥，是心肌細胞對多種病理刺激的一種共同反應。近年來，心肌肥大作為一種引起心血管疾病發(fā)病率和死亡率顯著升高的獨立危險因素和重要原因[1]，引起了人們的廣泛重視和高度關注，逆轉心肌肥大已成為當前治療高血壓及慢性充血性心力衰竭的重要目標之一。

第三軍醫(yī)大學藥劑教研室暨新藥研究中心在既往工作中，針對在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用的Gq蛋白α亞單位克隆制備出一種G蛋白抑制性多肽（G protein inhibitory peptide，GCIP）[2]，并從分子結構和理化性質方面對其進行了優(yōu)化設計，獲得了一種能夠顯著抑制體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞的肥大反應的優(yōu)化分子GCIP-27[3]。本研究擬從整體水平觀察GCIP-27對去甲腎上腺素誘導的小鼠心肌肥大的作用。

1 材料與方法

1.1 試藥

GCIP-27（采用固相方法合成，北京中科亞光科技公司，批號：C271401，純度：96%）；重酒石酸去甲腎上腺素（美國Serva公司，批號：L11386，純度：98%）；抗壞血酸（上?；瘜W試劑采購供應站，批號：970401，純度：99%）；酒石酸鉀鈉（重慶川東化工公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4）和免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術有限公司；抗c-Fos抗體和抗p-ERK1/2抗體（美國Santa Cruz公司）；濃縮型DAB顯色試劑盒和抗體稀釋液（武漢博士德公司）。

1.2 動物

健康清潔級小鼠50只，體質量（BW）20～24 g，♀♂各半，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物實驗合格證號：SCXK（渝）20020003。

忠誠、干凈、擔當是領導干部的核心素質，勇于擔當，就是要有強烈的責任意識，在其位，謀其政，高標準的履職盡責。動力廠強化擔當意識，推動崗位實踐融入中心工作。結合“四合格四詮釋”崗位實踐，廣大黨員干部銳意進取，攻堅克難，在大項目改造、裝置檢修搶修、優(yōu)化生產運行、節(jié)能降耗等工作中，奉獻擔當，用實際行動踐行“四合格”，做到“五帶頭”，干部員工隊伍奮發(fā)有為、敬業(yè)履職，圓滿完成生產經營任務，不斷開創(chuàng)各項工作新局面，推動企業(yè)發(fā)展取得新成效。

1.3 動物分組及模型建立

但是文獻[12]方案中尚存在不足：沒有考慮里層節(jié)點剩余能量小于能量閾值的情況以致網絡節(jié)點存活率低；小車在各方環(huán)的充電時間僅考慮節(jié)點平均消耗能量，節(jié)點剩余能量的均衡性可以進一步增強.針對上述不足，本文提出一種射頻能量捕獲網絡移動能量源均衡化充電策略，首先將區(qū)域劃分為六邊形網格，將六邊形的中心點作為小車移動過程中的停留點，將傳感器節(jié)點分層，給定能量源移動路徑，基于機會路由提出一種分配小車充電時間的算法，滿足相鄰兩層網絡節(jié)點剩余能量方差最小以實現(xiàn)節(jié)點能量的最大均衡化需求.本文的主要貢獻如下：

1.4 心肌肥大指標的測定[4]

小鼠心肌肥大指標測定完畢后，將左心室組織置于10%福爾馬林中固定24 h；石蠟包埋，切片。免疫組化采用SP法。切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，復合消化液消化20 min后加正常山羊血清封閉30 min。加一抗4℃過夜。次日復溫至37℃、1 h，滴加二抗工作液37℃、30 min，滴加鏈霉卵白素37℃、30 min，DAB顯色。以上步驟間均用0.01 mol·L－1PBS洗滌5 min×3次。蘇木精復染，常規(guī)脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。c-Fos的表達情況用陽性細胞率表示，光鏡下隨機選擇視野，分別計數(shù)細胞核總數(shù)與陽性細胞總數(shù)，二者比值為陽性細胞率。p-ERK1/2的表達采用真彩色醫(yī)學圖像分析軟件（Image-proplus 4.5）進行半定量分析。所有玻片均在同一放大倍數(shù)、同一光強度下分析，測量相同面積的平均光密度值。

本文摸索了一種專業(yè)論文文本大數(shù)據的挖掘方法，采用雙關鍵詞搜索，以論文標題為源數(shù)據，經過分詞、詞頻排序、專業(yè)論文中日常用詞語料庫匹配排除，得出有效專業(yè)詞匯列表。再通過人工方法對專業(yè)詞匯歸類，歸納出各級評價因子。并對詞頻頻率值進行統(tǒng)計計算，得出各評價因子權重，進而得到完整的評價體系表。

1.5 免疫組化檢測[5]

末次給藥后第2天，稱量小鼠BW后，頸椎脫臼處死，迅速開胸取出心臟，冰冷生理鹽水洗去血跡，濾紙吸干，天平稱量心臟重（HW）；小心去除心房和右心室（保留室間隔），稱量左心室重（LVW）；以左室重與體質量之比作為左心室指數(shù)（LVI），即心肌肥大指數(shù)；以全心重與體質量之比作為心臟指數(shù)（HI）；并計算左心室重/心臟重（LVW/HW）。

1.6 統(tǒng)計學方法

各組小鼠各心肌肥大指標檢測結果見表1。

由表1、圖1、圖2可見，對照組小鼠心肌組織中很少表達c-Fos，p-ERK1/2也僅有少量表達。與對照組比較，模型組的c-Fos表達明顯增強，陽性細胞率達（51.3±6.7）%；p-ERK1/2表達也明顯增強（P＜0.01）。經GCIP-27處理后，3個GCIP-27劑量組c-Fos和p-ERK1/2表達量均顯著減少（P＜0.01）。

2 結果

2.1 GCIP-27對小鼠心肌肥大的影響

表1 各組小鼠心肌肥大指標檢測結果（）Tab 1 Determination of index of cardiac hypertrophy in mice of each group（）

表1 各組小鼠心肌肥大指標檢測結果（）Tab 1 Determination of index of cardiac hypertrophy in mice of each group（）

與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.NA group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 劑量/μg·kg－1n BW/g HW/mg LVW/mg HI/mg·g－1LVI/mg·g－1LVW/HW/%對照組模型組GCIP-27組GCIP-27組GCIP-27組——1010301008 9 8 825.1±2.1923.2±1.6923.9±2.2423.5±2.0023.1±2.2698.8±9.68112.1±12.1＊101.0±13.398.6±18.8#95.2±5.79#70.8±8.2185.6±9.16＊＊73.4±10.2##71.3±14.6##67.9±6.30##3.95±0.314.82±0.44＊＊4.22±0.32##4.18±0.54##4.17±0.52##2.82±0.273.69±0.36＊＊3.06±0.21##3.02±0.44##2.98±0.48##71.6±.3.676.5±4.1＊72.7±2.4#72.3±4.4#71.2±30#

各組小鼠心肌組織中c-Fos和p-ERK1/2表達定量結果見表2，各組小鼠心肌組織c-Fos蛋白表達情況見圖1，p-ERK1/2表達情況見圖2。

取小鼠50只隨機分為對照組、模型組和GCIP-27（10、30、100 μg·kg－1，劑量選取參考文獻[2]）組（n＝10）。對照組給予0.1%抗壞血酸/0.003%酒石酸鉀鈉/生理鹽水；模型組給予0.1%抗壞血酸/0.006%重酒石酸去甲腎上腺素/生理鹽水（相當于去甲腎上腺素1.5 mg·kg－1）；GCIP-27組在給予去甲腎上腺素的同時，按照預實驗結果，給予GCIP-2710、30、100 μg·kg－1，各組給藥體積均為50 mL·kg－1，腹腔注射（ip），1日2次，連續(xù)15 d。

2.2 GCIP-27對小鼠肥大心肌組織c-Fos和p-ERK1/2表達的影響

在整個實驗期間，模型組和GCIP-27低、中、高劑量組小鼠分別死亡2、1、2、2只，各組間比較無統(tǒng)計學差異。各組小鼠BW之間比較無顯著性差異。與對照組比較，模型組小鼠HW、LVW、LVI、HI、LVW/HW均明顯增加。說明在本實驗條件下，應用GCIP-27各劑量后均能明顯抑制小鼠心肌肥大，除低劑量組HW（減輕9.9%，但P＞0.05）外，各劑量組的其它各項心肌肥大指標均有顯著改善，尤其是特異性反映心肌肥大的LVI，與模型組比較顯著降低（P＜0.01）。

表2 各組小鼠心肌組織中c-Fos和p-ERK 1/2表達定量結果（）Tab 2 The quantitation expression of c-Fos and p-ERK1/2 in myocardium of mice of each group（）

表2 各組小鼠心肌組織中c-Fos和p-ERK 1/2表達定量結果（）Tab 2 The quantitation expression of c-Fos and p-ERK1/2 in myocardium of mice of each group（）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.NAgroup：#P＜0.01

組別對照組模型組GCIP-27組GCIP-27組GCIP-27組p-ERK1/2表達量（光密度值）0.136±0.0180.307±0.054＊0.250±0.033#0.209±0.037#0.188±0.029#劑量/μg·kg－1n——1010301008 9 8 8 c-Fos表達量（陽性細胞率/%）2.6±3.051.3±6.7＊32.0±5.8#22.9±5.4#17.6±3.1#

圖1 各組小鼠心肌組織c-Fos蛋白表達情況（免疫組化染色，×200）A.對照組；B.模型組；C.GCIP-27中劑量組Fig1 The expression of c-Fos in myocardium of mice of each group（immunohistochemical staining，×200）A.control group；B.NAgroup；C.GCIP-27 middle dose group

圖2 各組小鼠心肌組織p-ERK1/2表達情況（免疫組化染色，×200）A.對照組；B.模型組；C.GCIP-27中劑量組Fig 2 The expression of p-ERK1/2 in myocardium of mice of each group（immunohistochemical staining，×200）A.control group；B.NAgroup；C.GCIP-27 middle dose group

2.2 乳酸水平比較 入組時兩組患者間乳酸水平相似，分別為(6.31±0.78) mmol/L和(6.13±0.62) mmol/L，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經過治療后兩組乳酸水平均有下降，且實驗組下降得更為明顯，到治療后第1 d、第3 d兩組乳酸水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

心肌肥大主要是心肌細胞體積增大的結果，即直徑增寬，長度增加；同時，心肌細胞內蛋白質含量增加，DNA、RNA以及蛋白質合成加強，所以心肌總量很快增長，導致整個心臟重增加，尤其是左心室重增加顯著。雖然心肌肥大早期有一定的代償作用，但增生的心肌組織最終造成心肌供血供氧不足，能量生成減少，心肌收縮性減弱。

So L5=950×I6+475+475-200=950×I6+750,L6=Ls-A1-A2-220-200-(950×I6+750)=Ls-A1-A2-950×I6-1 170

c-Fos是一種DNA結合蛋白，在核內起信使作用，將膜信號引發(fā)的胞漿事件與核內的基因活動聯(lián)系起來；與心肌細胞的生長、發(fā)育亦密切相關，在胚胎期心肌表達較高，出生后1周便消失。當心肌負荷增加或促心肌生長因素刺激時，早期常伴有c-Fos等原癌基因產物的有序表達，而后才出現(xiàn)心肌肥大[6]。c-Fos是組成由細胞表面刺激到出現(xiàn)相應的細胞效應的信息傳遞鏈的成分，在心肌肥大的反應中起著一種允許作用，促進心肌細胞蛋白質的合成。ERK（Extracellular signal regulated kinase）是一族分子量為40～60 KD的蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶，可對許多細胞外刺激發(fā)生反應而被快速激活。p-ERK1/2是ERK1/2的活化形式，ERK1/2活化為p-ERK1/2后，轉位入核，可磷酸化一系列轉錄因子和核蛋白，如c-Fos、c-myc、STAT等[7]，促進細胞的增殖和分化。

在心肌肥大的發(fā)生過程中，鳥苷酸結合蛋白Gq蛋白處于樞紐地位，去甲腎上腺素、血管緊張素Ⅱ、內皮素-1、神經肽Y等通過其相應的受體與Gq蛋白相偶聯(lián)[8]。Gq活化后，激活磷脂酶C，繼而催化磷脂酰肌醇-4、5-二磷酸（PIP2）水解生成1，4-三磷酸肌醇與二酰基甘油，前者引起細胞內Ca2+釋放，后者激活蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）。PKC與調控細胞增殖、分化有關，能促進多種蛋白質分子中絲氨酸或蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化反應，促進基因表達，刺激細胞的增殖，是肥大信號傳遞的共同通路之一，在肥大反應的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

GCIP-27是Gq蛋白α亞單位的蛋白羧基末端模擬肽，通過與受體結合阻礙鳥氨酸調節(jié)蛋白Gα蛋白分子效應，從而拮抗多種受體激動劑的功能，具有比拮抗單一受體更強的作用。本實驗室既往研究發(fā)現(xiàn)，合成肽GCIP-27能明顯減小去甲腎上腺素或血管緊張素Ⅱ刺激的體外培養(yǎng)心肌細胞的直徑、細胞內蛋白質含量和蛋白質合成速率。本實驗發(fā)現(xiàn)，GCIP-27能夠明顯減小去甲腎上腺素所誘導的小鼠心肌肥大，抑制心肌組織中p-ERK1/2表達，降低原癌基因c-Fos表達。說明GCIP-27不僅能在體外抑制心肌細胞的肥大反應，在整體情況下同樣具有顯著的抗心肌肥大作用，具有良好的開發(fā)應用前景。

[1]Tannous P，Zhu H，Nemchenko A，et al.Intracellular protein aggregation is a proximal trigger of cardiomyocyte autophagy[J].Circulation，2008，117（24）：3070.

[2]Zhou JZ，Li XH，Zhang HG，et al.Cloning and expression ofG-protein competitive inhibitory polypeptide（GCIP）and its prophylactic effects on myocardial hypertrophy in vitro[J].Acta Pharmacol Sin，2003，24（11）：1108.

[3]Li XH，Zhang HG.Optimization of G protein inhibitory polypeptide and its activities on cardiac hypertrophy in vitro and in vivo[J].Drug Dev Res，2005，66（3）：237.

[4]He Y，Zhong GQ，Wang Y，et al.Effects of hydrochlorothiazide and indapamide on left ventricular hypertrophy and eNOS expression in spontaneous hypertensive rats[J].China Pharmacol Bull，2006，22（10）：1184.

[5]Shen R，Gu Z L，Xie M L，et al.EGCC inhibition against collagen accumulation and cell proliferation in cardiac hypertrophy[J].Chin Pharmacol Bull，2006，22（9）：1095.

[6]Uusimaa P，Tokola H，Ylitalo A，et al.Plasma B-type natriuretic peptide reflects left ventricular hypertrophy and diastolic function in hypertension[J].Int J Cardiol，2004，97（2）：251.

[7]Nam K，Watanabe J，Ishihara K.Modeling of swelling and drug release behavior of spontaneously forming hydrogels composed of phospholipid polymers[J].Int J Pharm，2004，275（1～2）：259.

[8]Engler OB，Schwendener RA，Dai WJ，et al.A liposomal peptide vaccine inducing CD8+T cells in HLA-A2.1 transgenic mice，which recognise human cells encoding hepatitis C virus（HCV）proteins[J].Vaccine，2004，23（1）：58.