彭忠田，譚德明，黃順玲，朱平安，3，劉菲（.中南大學湘雅醫(yī)院，長沙市 40008；2.南華大學附屬第一醫(yī)院，衡陽市 4200；3.深圳市第七人民醫(yī)院，深圳市 5808）

乙型肝炎免疫球蛋白（Hepatitis B immunoglobulin，HBIG）是針對乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的特異性被動免疫制劑，其治療作用機制被認為是與血循環(huán)中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）特異性結合及中和HBV。而最近有研究[1～3]報道HBIG在體外細胞模型中能減少HBV的分泌或干擾包含HBV DNA中間體的核衣殼的包封。但慢性乙型肝炎患者體內HBsAg含量豐富，一般劑量的HBIG很快與循環(huán)中的HB-sAg結合，真正能進入肝實質細胞的量不足以抑制HBV，使HBIG的不能發(fā)揮應有的療效。納米粒是一種新型的藥物載體，藥物可通過溶解、包裹或吸附作用與納米粒結合。已有研究表明，藥物與納米粒結合后，跨膜轉運能力提高且藥效增強[4～6]。本研究選用人正常肝細胞株QSG7701細胞為體外細胞模型，對HBIG聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（Hepatitis B Immunoglobulin Polybutylcyano-Acrylate Nanoparticle，HBIGPBCA-NP）的細胞滲透情況進行研究，以探討藥物經納米化是否會提高HBIG的細胞滲透率，使進入細胞內HBIG的濃度增加。

1 材料

1.1 儀器

全自動紫外分光光度計（美國Beckman公司）；iCycler熒光實時聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國BIO-RAD公司）；ANYTEST 2000時間分辨熒光測定儀（上海新波生物技術有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國Quene公司）；IX70倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

HBIG注射劑（四川遠大蜀陽藥業(yè)有限公司，批號：20050704，規(guī)格：100 IU·mL－1）；HBIG-PBCA-NP（中南大學湘雅醫(yī)院傳染病研究所，批號：200508，規(guī)格：6.0 IU·g－1）；達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM，批號：SH3002201）、胎牛血清（FBS，批號：16000-044）均購自美國Gibco公司；乙型肝炎表面抗體（Hepatitis B surface antibody，HBsAb）定量檢測試劑盒（蘇州新波生物技術有限公司，批號：20040610）；HBV核酸擴增熒光檢測試劑盒（上海申友生物技術有限責任公司，批號：20050302）；MTT（批號：M-0793）、二甲基亞砜（DMSO，批號：D-0231）均購自美國Sigma公司。

1.3 細胞株及培養(yǎng)

QSG7701細胞株由中南大學湘雅醫(yī)院傳染病研究所保存。將QSG7701細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內，每瓶加入5～10 mL DMEM混合培養(yǎng)液（含10%FBS），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每3～4 d以消化液消化傳代，細胞每2～3 d換液1次。

2 方法

2.1 細胞毒性試驗

采用MTT比色試驗法。用含10%FBS的DMEM將QSG7701細胞配制成單個細胞懸液，以每1 cm21.5×104個接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔體積200 μL。試驗分8組：HBIG低、中、高濃度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）組，HBIG-PBCA-NP低、中、高濃度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）組，對照組（加細胞及10%FBS的DMEM培養(yǎng)基）和空白孔（不加細胞，只加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基），每組設5孔。放至37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，分別于培養(yǎng)24 h及72 h后每孔加入5 mg·mL－1MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h后，吸棄孔內培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，在酶標儀上選擇490 nm波長，以空白孔調零，測定各孔吸光度值。

2.2 HBIG及HBIG-PBCA-NP體外跨膜轉運作用研究[5]

用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將QSG7701細胞配成單細胞懸液，以每1 cm23×105個接種于12孔培養(yǎng)板中，24 h后待細胞貼壁生長狀態(tài)良好時進行試驗，試驗分7組：HBIG低、中、高濃度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）組、HBIG-PBCA-NP低、中、高濃度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）組、對照組（10%FBS的DMEM培養(yǎng)基），每組設5孔；與細胞共孵育，分別于加藥后培養(yǎng)2、4、8、16、24、48 h，小心吸取孔內培養(yǎng)上清液（保存于－20℃），待測HBsAb定量（預試驗時，另設含0.1、1.0 IU·mL－1HBIG及HBIG-PBCA-NP的10%FBS DMEM培養(yǎng)基組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h，以觀察細胞培養(yǎng)條件下HBIG及HBIG-PBCA-NP的穩(wěn)定性）。

通過下列方法計算細胞內HBIG濃度和HBIG滲透率：細胞內HBIG濃度＝藥物終濃度－培養(yǎng)上清液濃度；HBIG滲透率＝（細胞內藥物濃度/藥物終濃度）×100%。

采用時間分辨免疫熒光分析法進行HBsAb定量檢測以計算HBIG濃度。按照試劑盒操作說明進行。取試劑盒中所附的陰性對照、陽性對照、參考標準品及待檢測樣品[即“2.2”項中（保存于－20℃）培養(yǎng)上清液]各100 μL，按順序加入微孔反應條中并加貼封片；室溫下，振蕩儀緩慢振搖孵育1 h；洗板4次，拍干；每孔加入100 μL銪標記物工作液，并加貼封片；室溫下，振蕩儀緩慢振搖孵育1 h；洗板6次，拍干；每孔加入試劑盒中所附的增強液100 μL，并加貼封片；室溫下，振蕩儀緩慢振搖孵育5 min；用時間分辨熒光測定儀測定HBsAb濃度值，并轉化為HBIG濃度。

2.3 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 細胞毒性試驗結果

各組吸光度值結果見表1。

表1 各組吸光度值比較Tab 1 Comparison of absorbance value in each group

由表1可見，各試驗組之間以及試驗組與對照組之間吸光度值均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），表明所用藥物在本試驗濃度下無細胞毒性作用。

3.2 HBIG及HBIG-PBCA-NP體外跨膜轉運作用結果

預試驗研究表明，含0.1、1.0 IU·mL－1HBIG及HBIG-PBCA-NP的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h后，HBIG濃度與相應的標準濃度（即100 IU·mL－1的HBIG配制的0.1、1.0 IU·mL－1HBIG，6.0 IU·g－1的HBIG-PBCA-NP配制的0.1、1.0 IU·mL－1的HBIG-PBCA-NP）比較無顯著性差異（P＞0.05），表明HBIG及HBIG-PBCA-NP穩(wěn)定性好。

在不同時間點，各組細胞內HBIG濃度測定值見表2，各組 HBIG滲透率見圖1。

表2 各組不同時間點細胞內HBIG濃度（IU·mL－1）Tab 2 Intracellular HBIG concentration of cells in each group at different time（IU·mL－1）

圖1 各組不同時間點HBIG的滲透率（%%）Fig 1 The penetrability ratio of HBIG in each group at different time（%%）

由表2可知，細胞培養(yǎng)液中所加藥物終濃度分別為0.1、0.2、0.4 IU·mL－1時，HBIG組和HBIG-PBCA-NP組細胞內的HBIG濃度均隨培養(yǎng)時間的延長而增加，至24 h時已基本達最大值；HBIG組HBIG的胞內濃度盡管隨著胞外藥物濃度的增加、培養(yǎng)時間的延長而有所提高，但與HBIG-PBCA-NP組相比，后組升高更為明顯，且后組HBIG的胞內濃度在各時間點均明顯高于前組。至24 h時，HBIG-PBCA-NP組HBIG的胞內濃度約為HBIG組HBIG的胞內濃度的1.5倍。經統(tǒng)計學分析，2組之間比較具有顯著性差異（P＜0.05）。

由圖1可知，HBIG-PBCA-NP組HBIG滲透率均明顯高于HBIG組，兩兩相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

4 討論

研究[7]表明，IgG能通過體外跨膜轉運作用跨越不同物種的上皮細胞和內皮細胞屏障。QSG7701細胞是人正常肝細胞株，以上皮樣細胞為主，因此本試驗以此細胞株為模型研究HBIG的體外跨膜轉運作用。

MTT結果表明，HBIG及HBIG-PBCA-NP無明顯細胞毒性作用，不影響試驗研究。高、中、低濃度的HBIG及HBIGPBCA-NP跨膜轉運研究結果證明：納米化能增強HBIG的細胞內滲透能力，提高HBIG的滲透率和細胞內濃度，使進入細胞內的HBIG的量增加。納米化后細胞內的HBIG濃度約是未納米化的1.5倍，這為HBIG更有效地進入細胞內、減少HBV的分泌或干擾包含HBV DNA中間體的核衣殼的包封創(chuàng)造了良好的條件。但在動物細胞模型中納米化的HBIG是否仍有上述作用，值得深入研究。

HBIG納米粒較HBIG更容易跨膜轉運入肝細胞內的機制主要與肝細胞系的內攝納米粒作用有關。目前普遍接受的觀點是納米載體可攜帶大分子藥物，通過內吞途徑進入細胞，完成對吸收性上皮細胞的藥物轉運。藥物納米化后肝細胞跨膜轉運能力增強的機制目前尚不十分清楚，主要有如下解釋：（1）納米粒通過細胞內吞作用進入細胞；（2）納米粒被細胞膜吸附，黏附于細胞膜上，造成局部藥物濃度過高而產生濃度梯度，有利于藥物由胞外向胞內擴散；（3）藥物可與載體形成離子對，有利于藥物的跨膜轉運；（4）載藥納米粒可以改變膜運轉機制，增加藥物對生物膜的透過性，有利于細胞內藥效發(fā)揮[8]。

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[2]Peng ZT，Tan DM，Huang SL，et al.Inhibition of the secretion of HBsAg and HBV DNA in vitro by hepatitis B Immune globulin[J].J Gastroen Hepatol，2006，21（suppl 2）：A118.

[3]Peng ZT，Tan DM，Huang SL，et al.Inhibition of HBs-Ag and HBV DNA secretion by HBIG nanoparticles（HBIG-PBCA-NP）in vitro[J].J Hepatology International，2008，2（suppl 2）：S172.

[4]Alyautdin R，Gothier D，Petrov V，et al.Analgesic activity of the hexapeptide dalargin absorbed on the surface of poly（butylcyanoacrylate）nanoparticles[J].Eur J Pharm Biopharm，1995，41（1）：44.

[5]桂 卉，鄒 龍，范學工，等.鏈霉素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的體外跨膜轉運研究[J].中國藥科大學學報，2006，37（6）：499.

[6]馬滿玲，楊麗杰，陳 巖.肝靶向水溶性藥物納米化的研究進展[J].中國藥房，2009，20（1）：67.

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[8]Aboubakar M，Puisieux F，Couvreur P，et al.Physicochemical characterization of insulin-loaded poly（isobutylcyanoacrylate）nanocapsules obtained by interfacial polymerization[J].Int J Pharm，1999，183（1）：63.