蔣常文，夏春波，李鴻文，陳森洲，閆蘊(yùn)力，周 思，劉 瑛，蘭羚元

(桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，廣西桂林541004)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，目前其治療仍是世界公認(rèn)的難題。近年來研究表明，IL-18能誘導(dǎo)T細(xì)胞及NK細(xì)胞產(chǎn)生干擾素(IFN)-γ，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。有研究報(bào)道，將IL-18直接進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射可抑制膠質(zhì)瘤的生長，將IL-18基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗接種至裸鼠皮下或直接注射至瘤體內(nèi)可使致瘤性明顯降低［1］。IL-18處理的樹突狀細(xì)胞可抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的生長，提高荷瘤鼠存活率［2］。最近，我們將IL-18基因?qū)肽z質(zhì)瘤C6細(xì)胞，建立了C6/IL-18細(xì)胞，通過外源性IL-18基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑，觀察對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 IL-18基因、pLXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒以及親代膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞保存于河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞研究室。順鉑購自齊魯制藥有限公司。MTT(噻唑藍(lán))、二甲基亞砜購自Sigma公司，吖啶橙(AO)和溴化乙錠(EB)購自華美生物試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 C6/IL-18細(xì)胞的建立 應(yīng)用Lipofection將LXSN/IL-18轉(zhuǎn)染到ψ2細(xì)胞中，經(jīng)G418細(xì)胞(400 mg/L)篩選后，收集G418抗性細(xì)胞克隆的培養(yǎng)上清(內(nèi)含逆轉(zhuǎn)錄病毒)。在8 mg/ml聚凝胺(polybrene)存在下，將含逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)上清與PA317細(xì)胞共同培養(yǎng)進(jìn)行再次病毒包裝。收集具有G418抗性、高表達(dá)IL-18 mRNA的細(xì)胞克隆培養(yǎng)上清，獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，用于感染C6細(xì)胞。取增殖期的C6細(xì)胞，加入含8 mg/ml polybrene的病毒培養(yǎng)上清2 ml，6 h后加入新鮮培養(yǎng)液4 ml。24 h后加入G418(400 mg/L)篩選陽性克隆，獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染C6細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 C6/IL-18、C6/pLXSN及C6細(xì)胞均以RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素 100 U/ml、鏈霉素 100 μg/ml。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用生理鹽水將順鉑溶解、稀釋，使其終質(zhì)量濃度分別為0.3、3、30、60、120 μg/ml。

1.2.3 順鉑干預(yù)及細(xì)胞抑制率檢測 分別取對數(shù)生長期的 C6/IL-18、C6/pLXSN和 C6細(xì)胞，經(jīng)0.04%EDTA消化后，加入培養(yǎng)液吹打混勻，以1.5×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液。24 h 后分別加入 120、60、30、3、0.3 μg/ml的順鉑，每組均做3個(gè)復(fù)孔;設(shè)不加藥物為對照組。藥物與細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h后，離心，吸去上清，每孔加入150 μl DMSO終止反應(yīng)，振蕩儀振蕩10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測吸光度值(A值)。細(xì)胞抑制率=(對照孔A值-用藥孔A值)/對照孔A值×100%。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 順鉑干預(yù)及細(xì)胞凋亡率檢測 分別取對數(shù)生長期C6/IL-18、C6/pLXSN和C6細(xì)胞，經(jīng)0.04%EDTA消化后，加入培養(yǎng)液吹打混勻，以5×104/ml細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后加入終濃度為10倍血漿峰濃度(30 μg/ml)的順鉑。藥物作用24 h后，去除培養(yǎng)液，0.04%EDTA消化細(xì)胞，倒掉消化液，用0.1 mol/L PBS懸浮細(xì)胞，800 r/min離心6 min，加入含AO和EB(均為0.05 mg/ml)的熒光染液，吹打混勻，將細(xì)胞滴至載玻片上，熒光顯微鏡下觀察照相。鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取平均值。凋亡率 =凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù) ×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞抑制率 見表1。

表1 三種細(xì)胞抑制率比較(%，±s)

表1 三種細(xì)胞抑制率比較(%，±s)

注:與C6/pLXSN和親代C6細(xì)胞比較，*P＜0.05

順鉑質(zhì)量濃度(μg/ml)親代C6細(xì)胞C6/IL-18細(xì)胞C6/pLXSN細(xì)胞120 75.92±5.56*61.46±5.34 59.54±3.08 60 65.58±3.08* 54.13±6.52 53.92±5.18 30 58.05±5.34* 47.16±6.08 46.37±5.34 3 29.66±7.40* 21.30±5.19 20.96±4.81 0.3 5.92±1.35 6.46±2.11 5.86±1.58

2.2 細(xì)胞凋亡率 C6/IL-18細(xì)胞、C6/pLXSN細(xì)胞和C6細(xì)胞的凋亡率分別為24.12% ±3.13%、12.07% ±1.87%、11.52% ±1.93%。C6/IL-18細(xì)胞的凋亡率明顯高于C6/pLXSN和C6細(xì)胞(P均＜0.05)，C6/pLXSN和C6細(xì)胞凋亡率比較無顯著性差異。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，呈浸潤性生長，與周圍腦組織邊界不清，具有治療困難、生存期短、病死率高的特點(diǎn)，患者平均生存期為6～10個(gè)月，1 a生存率僅為30%，5 a生存率低于5.5%［3，4］。順鉑屬于金屬類化合物，能與細(xì)胞內(nèi)生物大分子的親核基團(tuán)結(jié)合，引起DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。近年來，隨著采用高滲性開放血腦屏障、選擇性頸內(nèi)動脈灌注、間質(zhì)化療及鞘內(nèi)注射等方法的應(yīng)用，使得順鉑可通過血腦屏障，在膠質(zhì)瘤的治療中取得較好效果［5，6］。研究顯示，將鉑類抗腫瘤藥單獨(dú)應(yīng)用或與亞硝基脲類、足葉乙甙、替莫唑胺聯(lián)合已顯示出良好的抗腦腫瘤效果［7］;有學(xué)者認(rèn)為將順鉑與腫瘤壞死因子聯(lián)合應(yīng)用可增加對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的殺傷作用［8］。

鑒于IL-18基因?qū)δ[瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，最近有研究者將IL-18與異磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)可增加對骨肉瘤荷瘤鼠肺轉(zhuǎn)移的抑制效果［9］。認(rèn)為IL-18增加腫瘤對化療敏感性的機(jī)制與IL-18能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 fasL表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡有關(guān)［10］。Chandrasekar等［11］研究表明，IL-18 在體外可誘導(dǎo)心血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與IL-18促進(jìn)抑癌基因的表達(dá)、激活Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡抑制基因表達(dá)有關(guān)。但關(guān)于IL-18基因與順鉑結(jié)合是否能夠增加對膠質(zhì)瘤殺傷作用，目前尚缺乏研究。

綜上所述，我們在以往研究的基礎(chǔ)上將IL-18基因與順鉑結(jié)合探討對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果表明IL-18基因與順鉑結(jié)合可明顯增加對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用。該結(jié)果對于增加化療藥物的敏感性，減低藥物的毒副作用，提高膠質(zhì)瘤的治療效果有一定的參考意義。

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