杜書君 唐斌斌 高海

（1陽谷縣人民醫(yī)院，山東 陽谷 252300；2陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710000）

枸櫞酸西地那非是治療男性勃起功能不良的一種藥物。自1997年3月由美國食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市以來,該藥因其療效確切，至2000年上半年，全球已有100多個國家批準(zhǔn)使用。但在使用過程中發(fā)現(xiàn)其可導(dǎo)致臥位低血壓,尤以同時服用硝酸酯類或含硝酸根的藥物更為明顯，嚴(yán)重者可引起心肌梗死甚至死亡[1]。美國心臟病學(xué)院和美國心臟病學(xué)會已明確指出,24 h內(nèi)使用過硝酸酯類藥物者禁用西地那非。我國也對西地那非的生產(chǎn)、經(jīng)營及使用進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。然而，目前在補(bǔ)腎壯陽類中藥制劑和保健食品中違法添加枸櫞酸西地那非的情況甚為嚴(yán)重。為有效打擊這種不法行為，建立一套方便可行的中藥保健品中西地那非成分測定方法是非常有必要的。

圖1 西地那非對照品和樣品的全離子掃描圖

1 材料

1.1 儀器

Quattro Micro API系統(tǒng)液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括ESI（電噴霧電離）源，Waters6890液相色譜儀，Waters公司Massl-ynx 4.1質(zhì)譜解析工作站。

1.2 試藥

西地那非對照品（純度≥99%，購自中國藥品生物制品檢定所，110857-200608）；西地那非供試品：鎖陽固精丸（批號：060505，060508，060511），甲醇（色譜純，山東禹王公司）；乙腈（色譜純，廣州飛獅化工有限公司）；水為高純水，其他試劑均為分析純。

圖2 西地那非對照品和樣品的子離子掃描圖

2 方法與結(jié)果

2.1 西地那非對照品溶液的制備

精密稱取西地那非對照品5.01 mg，置50 mL容量瓶中，用流動相超聲溶解然后定容至刻度。配制成含西地那非50 μg/mL的對照品儲備溶液。精密吸取該儲備液適量，用流動相逐級稀釋，制成濃度為 1，2，3，4，5 μg/mL 的系列對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品一丸，稱重，再將其粉碎成小顆粒，精密稱重。置100 mL容量瓶中，加流動相超聲溶解至無大顆粒狀物質(zhì)，加流動相定容至刻度，混勻，放置過夜。經(jīng)過沉淀后取上層溶液適量，10 000 r/min，離心10 min，上清液過微孔濾膜，濾液用流動相稀釋100倍，即得。

2.3 測定條件

2.3.1色譜條件C18色譜柱（2.1×100 mm，3.5 μm）流動相：0.01 mol/L，乙酸銨∶乙腈∶甲醇（55∶10∶35），流速 0.2 mL/min,柱溫 30℃，進(jìn)樣量 1 μL。

2.3.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI），掃描范圍：m/z 100～1 000,毛細(xì)管電壓3 KV，錐孔電壓：40 V，離子源溫度：110 ℃，脫溶劑溫度：350 ℃，脫溶劑氣體：450 L/hr，錐孔氣：50 L/hr，自動進(jìn)樣器直接進(jìn)樣，負(fù)離子方式檢測。通過Full Scan，SIR，Daughter對樣品進(jìn)行測定。結(jié)果在鎖陽固精丸中檢測出西地那非。根據(jù)樣品SIR圖中色譜峰的峰面積與對照品的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算西地那非的摻入量。西地那非對照品和樣品的全離子掃描、子離子掃描以及碎片離子掃描圖，分別見圖1，圖2，圖3。

圖3 西地那非對照品和樣品的碎片離子掃描圖

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系

將“2.1”項(xiàng)下的系列對照品分別進(jìn)樣1 μL，每一濃度做3次平行實(shí)驗(yàn)。以對照品濃度X為橫軸，色譜峰面積Y為縱軸進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：

Y＝3 344 085X－3 805.19 r＝0.999 7結(jié)果表明西地那非濃度在1～5 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.2 精密度試驗(yàn)

將濃度為3 μg/mL的對照品溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量為1 μL，西地那非峰面積RSD為1.26%（n＝5）。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將“2.2”項(xiàng)的供試品分別在 0，2，4，6，8 h 進(jìn)樣，測定西地那非的峰面積，其峰面積的RSD為1.2%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

對同一批樣品分別取樣5份，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行溶液制備，在上述測定條件下進(jìn)行分析測定，結(jié)果測得該批樣品的西地那非含量為1.37%，RSD為1.3%（n＝5）。

3.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品9份，每份50 mg，分別加入50 μg/mL 的對照品溶液 10，15，20 mL，每種濃度各 3 份，按“2.2”項(xiàng)下制備溶液，各進(jìn)樣1 μL，3個濃度的平均回收率分別為103%，105%，98%，RSD分別為1.61%，1.76%，1.49%。

3.6 樣品測定

取3個批號的樣品，采用的對照品溶液參見“2.1”項(xiàng)，按“2.2”項(xiàng)下操作制備供試品溶液。進(jìn)樣1 μL，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中西地那非的含量，結(jié)果3批樣品中西地那非含量（n=3）分別為 1.32%，1.36%，1.48%，RSD分別為1.98%，1.86%，1.75%。

4 結(jié)果與討論

中藥制劑及保健品中擅自添加枸櫞酸西地那非等物質(zhì)，日常多使用薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測。然而僅從TLC、HPLC法的保留時間一致上還不能充分肯定樣品中是否含有西地那非，需要通過液質(zhì)聯(lián)用方法進(jìn)一步確認(rèn)。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，若供試品HPLC色譜峰保留時間與西地那非對照品色譜峰一致，并且供試品該色譜峰液質(zhì)聯(lián)用的一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜均與相應(yīng)西地那非對照品一致，則可認(rèn)為供試品中含有西地那非[2]，故日常檢測工作中往往在使用TLC和HPLC進(jìn)行保留時間定性后還需進(jìn)一步使用質(zhì)譜對物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行最終的明確。本文采用日益廣泛使用的液質(zhì)聯(lián)用儀器，同時完成了樣品中違禁成分西地那非的定性和定量分析，該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可作為中成藥、保健品質(zhì)量控制的有效方法。

[1]遲丹怡.西地那非的不良反應(yīng)[J].藥物不良反應(yīng)雜志，2003，5(5)：352-354.

[2]國家藥典委員會.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)[S].2000.