李相軍,王 丹,石 艷,苗春生,孫 波

(吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室,吉林長春130021)

腎間質(zhì)纖維化是腎臟重要且常見的病理過程,成纖維細(xì)胞是主要的腎間質(zhì)細(xì)胞,能夠產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。AngⅡ是引起腎間質(zhì)纖維化發(fā)生重要原因之一。研究表明,銀杏葉提取物(GBE)具有廣泛的藥理作用,其主要成分黃酮化合物具有明顯的抗氧化和自由基清除活性[1],并對(duì)肝纖維化的預(yù)防有一定作用[2],但GBE對(duì)腎纖維化的防治效果尚未見報(bào)道。本研究主要探討GBE對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖作用及其對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 體重100 g Wistar大鼠由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,DMEM培養(yǎng)基(Gibco),標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司),逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptII(Invitrogen),TaqDNA聚合酶(北京鼎國生物技術(shù)公司),DNA Marker(DL-2000,Takara),PCR引物(上海生工生物技術(shù)公司合成),兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司),兔抗大鼠CTGF多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)。

1.2 大鼠腎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞從正常Wistar大鼠腎髓質(zhì)中培養(yǎng)獲得。參考Rodemann等[3]的方法進(jìn)行分離培養(yǎng),具體步驟為:將腎髓質(zhì)切成1 mm3小塊,加入0.25%胰酶37℃消化5-10 min,將消化后組織懸液過200目篩網(wǎng),濾液于1 000 r/min離心10 min,棄上清,用培養(yǎng)液洗滌兩次,加入含 20%胎牛血清的培養(yǎng)液,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)長出細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)表型確定為成纖維細(xì)胞。

1.3 GBE對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響 應(yīng)用MTT比色法測(cè)定腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖能力。取傳代4-8代腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞,接種于96孔板中,每孔1×104個(gè)/孔,加無血清培養(yǎng)液37℃孵育24 h,使細(xì)胞生長同步化后加入AngⅡ(10-6mol·L-1)刺激,并在AngⅡ基礎(chǔ)上加入不同濃度GBE(終濃度分別為0,25,50,100 和 200 mg·L-1),分別為 M 、GBE1、GBE2、GBE3和GBE4。分別作用2 h、6 h、16 h、24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞。對(duì)照組和處理組均重復(fù)3次。于刺激結(jié)束前4 h加入MTT 20 μ L/孔(5 g/L),37 ℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),吸棄上清液,每孔加入150 μ L DMSO,振蕩混勻10 min后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm波長處測(cè)定光吸收值,用只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

1.4 RT-PCR檢測(cè)TGF-β1及 CTGF mRNA表達(dá)細(xì)胞經(jīng)各種處理后,以Trizol法提取總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增 。TGF-β1上游引物5′-CCA AGG AGA CGG AAT ACA GG-3′,下游引物 5′-GTG TTG GTT GTA GAG GGC AAG-3′,CTGF 上游引物 5′-CTA AGA CCT GTG GAA TGG GC-3′,下游引物 5′-CTC AAA GAT GTC ATT GCC CCC-3′。GAPDH上游引物PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mg·L-1溴化乙錠),用計(jì)算機(jī)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描分析,以GAPDH密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn),TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)水平用所測(cè)定的TGF-β1和CTGF擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶密度與GAPDH電泳條帶密度的比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GBE對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

與正常對(duì)照組(C組)比較,含AngII(10-6mol·L-1)的模型組(M組)在培養(yǎng)16 h后,腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖開始加快,培養(yǎng)24 h后,M組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。Ang II的這種作用可被含GBE的培養(yǎng)液所抑制,且與GBE的濃度和培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。在培養(yǎng)24 h時(shí),當(dāng)銀杏葉提取物濃度為50 mg·L-1(GBE2 組)和 25 mg·L-1(GBE1 組)時(shí)抑制作用最明顯(與M組比較,差異顯著,P＜0.01,P＜0.05);在培養(yǎng) 48 h時(shí),除上述GBE1、GBE2組外,GBE3組(銀葉提取物濃度為100 mg·L-1)也顯示出明顯的抑制成纖維細(xì)胞過度增殖的能力(P＜0.05);而在培養(yǎng)72 h后,所有濃度的GBE均表現(xiàn)出了抑制成纖維細(xì)胞過度增殖的能力(P＜0.05)。見表1。

Tab.1 Effects of GBE extract on fibroblast proliferation in renal interstitium(n=8,±s)

Tab.1 Effects of GBE extract on fibroblast proliferation in renal interstitium(n=8,±s)

*P＜0.05 vs C group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs M group

group 2 h 6 h 16 h 24 h 48 h 72 h C 0.50±0.05 0.61±0.03 0.76±0.08 0.65±0.14 1.13±0.16 1.42±0.16 M 0.48±0.04 0.63±0.05 0.83±0.05 0.94±0.12* 1.46±0.27* 1.71±0.26*GBE1 0.27±0.04* 0.52±0.05* 0.52±0.10△ 0.69±0.09△ 1.08±0.15△△ 1.31±0.25△△GBE2 0.31±0.05* 0.59±0.02 0.60±0.06△ 0.59±0.15△△ 1.27±0.20△ 1.47±0.21△GBE3 0.37±0.09* 0.59±0.05 0.57±0.13△ 0.84±0.20 1.20±0.16△ 1.43±0.19△GBE4 0.48±0.07 0.61±0.05 0.63±0.09△ 0.78±0.13 1.32±0.24 1.51±0.22△

2.2 各組培養(yǎng)細(xì)胞 TGF-β1和 CTGF mRNA表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示,不同條件培養(yǎng)液培養(yǎng)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞48 h后,M 組細(xì)胞TGF-β1及CTGF mRNA表達(dá)量明顯高于C組細(xì)胞的表達(dá)量(P＜0.01)。除GBE1組細(xì)胞TGF-β1表達(dá)量與M組差異無顯著性外,其他不同濃度GBE組細(xì)胞TGF-β1及CTGF mRNA表達(dá)量均明顯低于M組(P＜0.05,P＜0.01)。見圖1。

Fig.1 Comparison of TGF-β1and CTGF mRNA expression in various groups

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同通路,是導(dǎo)致慢性腎衰竭的病理學(xué)基礎(chǔ),其發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜,可表現(xiàn)為腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、活化和表型轉(zhuǎn)分化,并在一些促纖維化因子的參與下,使細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚等[3]。參與腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑眾多,TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展的信號(hào)通路之一[4]。在正常的腎臟內(nèi)僅有微量的TGF-β1,而纖維增生的腎間質(zhì)、受損的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)TGF-β1表達(dá)顯著增加,且表達(dá)量與腎間質(zhì)纖維化程度正相關(guān)。CTGF是 TGF-β1的下游因子 ,主要介導(dǎo) TGF-β1的促細(xì)胞外基質(zhì)分泌作用。因此本研究主要以腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察不同濃度、不同時(shí)間銀杏葉提取物對(duì)其影響以及對(duì)TGF-β1和CTGF的干預(yù)作用。

GBE是從銀杏葉中提取的天然活性物質(zhì),其有效成分為黃酮甙及銀杏內(nèi)酯。臨床上多用于心腦血管病、哮喘等的防治。有學(xué)者用銀杏葉片治療糖尿病腎病等腎小球病變,可降低血漿BUN和Cr濃度,改善患者的腎功能[5]。近年來發(fā)現(xiàn)其對(duì)腎臟具有明顯保護(hù)作用[6,7]。我們既往的研究結(jié)果也表明,銀杏葉制劑對(duì)UUO大鼠腎臟功能和結(jié)構(gòu)具有明顯保護(hù)作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ?qū)δI間質(zhì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用可被含GBE的培養(yǎng)液所抑制,且與GBE的濃度和培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。在培養(yǎng)24 h時(shí),銀葉提取物濃度為25 mg·L-1和50 mg·L-1時(shí)抑制作用最明顯 ,而在培養(yǎng)72 h后,所有濃度的GBE均表現(xiàn)出了抑制成纖維細(xì)胞過度增殖的能力。RT-PCR結(jié)果顯示,不同濃度GBE培養(yǎng)液培養(yǎng)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞48 h后,TGF-β1及CTGF mRNA表達(dá)量均明顯低于模型組,說明GBE可能通過抑制纖維細(xì)胞的增殖及致纖維化因子的表達(dá),進(jìn)而阻斷纖維化進(jìn)程,為腎纖維化的防治開辟一個(gè)新的領(lǐng)域。

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