周 曄,鄧安梅,谷明莉,陳 燕,陳 波,陳孫孝,仲人前*

(1.上海長(zhǎng)征醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科;2.上海長(zhǎng)征醫(yī)院 皮膚科,上海200003)

新生隱球菌是一種具莢膜的酵母樣真菌,最常侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起隱球菌性腦膜炎。隱球菌性腦膜炎臨床主要表現(xiàn)為亞急性或慢性腦膜炎、腦膜腦炎,少數(shù)可表現(xiàn)為顱內(nèi)占位性病變[1-3]。近年來(lái),由于大劑量糖皮質(zhì)激素及抗腫瘤化療藥物的使用、腫瘤、AIDS、移植后抗排斥藥物的使用等因素,隱球菌病的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢(shì)[4-6]。據(jù)統(tǒng)計(jì),美國(guó)約有5%-10%的AIDS患者發(fā)生隱球菌性腦膜炎,而我國(guó)以散發(fā)非AIDS人群為主,但也有AIDS并發(fā)隱球菌性腦膜炎的報(bào)告。

然而,臨床治療具有較大難度,通常采用的抗真菌藥物具有較大毒性[7],因此迫切需要對(duì)隱球菌性腦膜炎的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究,以尋求更為有效的治療途徑。由于隱球菌性腦膜炎多發(fā)于免疫功能低下的個(gè)體,因此免疫失調(diào)可能是其發(fā)病機(jī)制中的重要因素之一[8],對(duì)隱球菌性腦膜炎患者中調(diào)節(jié)免疫功能的分子的研究,將為病情監(jiān)控和有效治療提供新的線索。

顆粒酶 B(granzyme B,GrB)、顆粒溶素(granulysin,GNLY)及穿孔素(perforin,又稱pore-forming protein,PFP)是存在于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)和自然殺傷細(xì)胞(natural killer,NK)細(xì)胞顆粒中的細(xì)胞免疫效應(yīng)分子[9]。在CTL發(fā)揮胞吐顆粒作用時(shí),PFP在靶細(xì)胞膜表面先構(gòu)筑小孔,使GNLY、GrB易于進(jìn)入細(xì)胞,通過(guò)激活caspase-3途徑使DNA裂解,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。本研究應(yīng)用免疫印跡的方法檢測(cè)隱球菌性腦膜炎患者PBMC中的GrB、GNLY及PFP的蛋白表達(dá),用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)其中GrB、GNLY及PFP的mRNA基因表達(dá),并且分析隱球菌性腦膜炎患者蛋白表達(dá)量與一些免疫指標(biāo)的相關(guān)性,探討免疫效應(yīng)分子與隱球菌性腦膜炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,以期為臨床提供一些輔助診斷的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 1999-2007年間在上海長(zhǎng)征醫(yī)院確診的隱球菌性腦膜炎患者25例,男11例,女14例,平均年齡38(31-58)歲,所有病例均為腦脊液找到和(或)腦脊液培養(yǎng)出新型隱球菌。正常對(duì)照組30例,男12例,女18例,平均年齡 35(25-55)歲。所有標(biāo)本均為HIV陰性。本研究得到患者同意和上海長(zhǎng)征醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器 淋巴細(xì)胞分離液(Axis-Shield PoC AS,Oslo,Norway),DU640型紫外分光光度儀(Beckman,Fullerton,CA,USA),Trizol試劑,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),TaqMan Universal PCR Master Mix,ABI prism 7500型熒光定量PCR儀(Prism 7500,Applied Biosystems,Foster City,CA,USA),DADE BEHRING BN2特定蛋白分析儀(BN2;Dade Behring,Deerfied,IL,USA),IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ ELISA 試劑盒 (BIOSOURCE,Carlsbad,CA,USA)。GrB、PFP單克隆抗體(Abcamambridge,England,UK),GNLY單克隆抗體由美國(guó)斯坦弗大學(xué)惠贈(zèng),HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(KPL公司)。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)合成 參照GENEbank中人18s rRNA、GrB、GNLY和PFP基因序列設(shè)計(jì)合成引物和探針,委托美國(guó)ABI生物公司合成。序列見表1。

表1 熒光定量RT-PCR的引物和探針序列

1.4 分離PBMC及抽提總RNA 無(wú)菌抽取靜脈血3 ml注入枸櫞酸鈉抗凝管,加等量生理鹽水稀釋一倍后加于Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上,以2 000轉(zhuǎn)/分的速度水平離心20分鐘后收集白細(xì)胞層細(xì)胞。用PBS洗滌兩次后分裝兩管,一管用于western blot,另一管加入Trizol,提取細(xì)胞總RNA,操作按說(shuō)明書進(jìn)行,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫印跡反應(yīng)(Western blot)將分離到的患者和健康人的PBMC用超聲破碎儀裂解細(xì)胞,離心后的上清液用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度,保證每孔上樣量的一致。經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)印,200 mA,40V,2 h。將轉(zhuǎn)印后的硝酸纖維素薄膜用含5%BSA的PBS封閉1 h,與1∶1 000稀釋的GrB、GNLY和PFP、β-actin抗體反應(yīng)2 h,充分洗滌后與1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體反應(yīng)2 h,ECL反應(yīng),X光片壓片曝光,用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定其吸光度值。以β-actin為參照,計(jì)算各蛋白的吸光度值與對(duì)應(yīng)的β-actin吸光度值,得到各蛋白相對(duì)水平。

1.6 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取總RNA 2 μ g進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) ,體系含 lxRT Buffer,0.5 mmol/L dNTPs,1 μ mol/L Oligo-dT引物,RNase抑制劑1O U,SuperseiptatTMⅡ反轉(zhuǎn)錄酶 4 U,反應(yīng)條件為:25℃10 min;42℃50 min;85℃5 min;冰浴 5 min 后加入 1 μ l E.coli RNase H,37℃20 min。cDNA置-20℃保存。

1.7 定量PCR反應(yīng) 20 μ l反應(yīng)體系中含有模板cDNA 1 μ l,PCRMaster mix 10 μ l,Sense-primer 0.4 μ l,Anti-sense-primer 0.4 μ l,Probe 0.2 μ l,RNAase-free 水8 μ l,循環(huán)參數(shù)為:50℃2min;95℃10 min;95℃15 s,60℃1 min,40個(gè)循環(huán);同時(shí)設(shè)RT質(zhì)控和PCR擴(kuò)增兩個(gè)空白對(duì)照。根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因18s rRNA的Ct差值,求出兩組標(biāo)本TRAIL的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 IgG、IgA、IgM采用 DADE BEHRING BN2全自動(dòng)特定蛋白分析儀檢測(cè) 血清IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ濃度采用ELISA試劑盒檢測(cè),步驟參照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書。

1.9 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 靶基因的相對(duì)定量按公式得出:靶基因 =2-(△△Ct)。其中 ΔΔ Ct=Δ Ct,Q-Δ Ct,C。Δ Ct,Q為疾病組靶基因的Ct值與管家基因Ct值之差;Δ Ct,C為對(duì)照組靶基因的Ct值與管家基因Ct值之差。測(cè)定 Δ Ct值以±s表示,組間差異采用成組t檢驗(yàn),以SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 GrB、GNLY和PFP蛋白表達(dá)量

以β-actin為內(nèi)參照,與健康對(duì)照組比較,隱球菌性腦膜炎患者PBMC中GNLY、PFP蛋白含量均明顯降低,而GrB蛋白含量無(wú)明顯變化,見圖1。計(jì)算健康對(duì)照組和隱球菌性腦膜炎患者PBMC中各蛋白的吸光度值與對(duì)應(yīng)的β-actin吸光度值,得到各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析GNLY和PFP表達(dá)顯著降低(P＜0.01),GrB的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05),見圖 2。

圖1 Western blot檢測(cè)隱球菌性腦膜炎患者和健康人PBMC中 GNLY、GrB、PFP蛋白

2.2 GrB、GNLY和 PFP mRNA表達(dá)量

采用熒光定量PCR技術(shù)分析隱球菌性腦膜炎患者PBMC中GrB、GNLY和PFP mRNA表達(dá)量,以2-(△△Ct)代表基因表達(dá)的相對(duì)定量,結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組比較,隱球菌性腦膜炎患者PBMC中GNLY、PFP mRNA表達(dá)量顯著降低(P＜0.01),GrB mRNA表達(dá)量與正常對(duì)照組的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異,見圖3。

圖2 隱球菌性腦膜炎患者PBMC中 GNLY、GrB、PFP蛋白的相對(duì)表達(dá)(*P＜0.01)

圖3 隱球菌性腦膜炎患者PBMC中GNLY、GrB、PFP mRNA的相對(duì)表達(dá)(*P＜0.01)

2.3 GNLY、PFP蛋白表達(dá)與隱球菌性腦膜炎患者血清IgG的相關(guān)性分析

本研究結(jié)果顯示:與健康對(duì)照組比較,隱球菌性腦膜炎患者血清IgG顯著下降(P＜0.01),經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,隱球菌性腦膜炎患者PBMC中GNLY蛋白表達(dá)與IgG成正相關(guān)(r=0.477,P＜0.05)、PFP蛋白表達(dá)與IgG無(wú)相關(guān)性(r=0.199,P=0.341),見表2和圖4。

表2 隱腦患者免疫指標(biāo)分析 (±s,g/L)

表2 隱腦患者免疫指標(biāo)分析 (±s,g/L)

隱腦患者組與健康人對(duì)照組比較,*P＜0.01

組別 例數(shù) IgG IgA IgM對(duì)照組 25 12.75±1.56 1.45±0.32 1.23±0.27患者組 30 7.62±1.24*1.56±0.57 1.31±0.71

2.4 GNLY、PFP蛋白表達(dá)與隱球菌病患者血清細(xì)胞因子水平的相關(guān)性分析

經(jīng)ELISA分析顯示:與健康對(duì)照組比較,隱球菌性腦膜炎患者血清中的IL-10顯著升高(P＜0.01)、IFN-γ顯著下降(P ＜0.01),IL-4、TNF-α的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示,隱球菌性腦膜炎患者PBMC中GNLY蛋白表達(dá)與血清中IL-10水平成負(fù)相關(guān)(r=-0.505,P＜0.05),而與血清IFN-γ水平成正相關(guān)(r=0.534,P＜0.05);隱球菌性腦膜炎患者PBMC中PFP蛋白表達(dá)與IL-10、IFN-γ水平均無(wú)相關(guān)性,見表3和圖5。

表3 隱腦患者細(xì)胞因子濃度水平分析 (±s,pg/ml)

表3 隱腦患者細(xì)胞因子濃度水平分析 (±s,pg/ml)

隱腦患者組與健康人對(duì)照組比較,*P＜0.01

組別 例數(shù) IL-4I L-10I FN-γ TNF-α對(duì)照組 25 2.08±0.45 1.59±0.41 70.19±4.88 1.48±0.23患者組 30 2.14±0.39 3.39±0.42*5.23±0.55*1.41±0.19

圖4 (A)隱球菌性腦膜炎患者GNLY蛋白表達(dá)與血清IgG的相關(guān)性,(B)隱球菌性腦膜炎患者PFP蛋白表達(dá)與血清IgG的相關(guān)性

圖5 隱球菌性腦膜炎GNLY、PFP蛋白表達(dá)與血清細(xì)胞因子水平的相關(guān)性

3 討論

新生隱球菌是一種條件致病菌,隱球菌病常見于免疫缺陷患者和機(jī)體免疫力低下者[11]。隱球菌性腦膜炎臨床表現(xiàn)多樣:發(fā)熱、頭痛、惡心、惡吐、腦膜刺激征常見,同時(shí)可出現(xiàn)意識(shí)障礙、腦神經(jīng)受損等癥狀[12]。其病情重、治療困難,病死率高。研究隱球菌性腦膜炎患者中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制將有利于病情監(jiān)控和治療。

顆粒酶B(GrB)屬于絲氨酸蛋白家族成員,存在于活化的CTL和NK胞漿中,是CTL和NK發(fā)揮細(xì)胞毒作用的主要效應(yīng)分子。活化的CTL識(shí)別靶細(xì)胞后,以顆粒外排的方式將顆粒酶分泌到細(xì)胞間隙以殺傷細(xì)胞。顆粒溶素是細(xì)胞毒顆粒蛋白,正常狀態(tài)下GNLY呈低水平表達(dá),免疫激活后3-5天GNLY的表達(dá)量開始上升,成為晚期表達(dá)的免疫效應(yīng)分子。穿孔素是一種結(jié)構(gòu)和功能類似補(bǔ)體C9的蛋白[13],存在于CTL與NK的胞漿顆粒中,在保護(hù)機(jī)體抗胞內(nèi)病原體如細(xì)菌、病毒、寄生蟲感染、抗腫瘤和同種排斥應(yīng)答中起重要作用,是免疫系統(tǒng)重要的效應(yīng)分子。靜止的CD8+細(xì)胞前體細(xì)胞內(nèi)PFP的表達(dá)水平非常低,然而一旦激活,其PFP的表達(dá)水平顯著升高。因此,上述三種分子被看作是機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的生物標(biāo)志之一。本研究檢測(cè)的25名隱球菌性腦膜炎患者PBMC中GNLY、PFP蛋白含量和mRNA均明顯降低,提示隱球菌性腦膜炎患者中細(xì)胞免疫力下降,這可能是導(dǎo)致發(fā)病的重要原因。而GrB蛋白含量無(wú)明顯變化,這可能是由于它們的表達(dá)調(diào)控機(jī)制不同所造成的。隱球菌性腦膜炎患者中血清IgG水平顯著降低,是病情指標(biāo)之一。本研究中,GNLY、PFP的表達(dá)水平與血清IgG水平成正相關(guān),提示檢測(cè)GNLY、PFP有助于對(duì)病情的監(jiān)測(cè)和臨床治療藥物的選擇。

Th1型免疫應(yīng)答能夠分泌Th1型細(xì)胞因子(如IFN-γ),在強(qiáng)化細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及對(duì)宿主抵抗細(xì)胞內(nèi)病原菌過(guò)程中發(fā)揮重要作用,而Th2型免疫應(yīng)答分泌Th2細(xì)胞因子(如IL-10)卻可能抑制Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,加重感染病情[14]。本研究中,隱球菌性腦膜炎患者IFN-γ水平顯著下降,IL-10水平顯著升高,呈現(xiàn)Th2漂移,因此IFN-γ可與其他抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用于新生隱球菌感染的免疫治療。有研究表明[15],GNLY還具有免疫調(diào)節(jié)作用,可刺激IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌。本研究中,隱球菌性腦膜炎患者中GNLY蛋白的低水平表達(dá)與血清IgG和IFN-γ水平成正相關(guān),與IL-10水平成負(fù)相關(guān)(P＜0.05),提示顯著降低的GNLY表達(dá)可能導(dǎo)致Th1/Th2失衡,機(jī)體抗真菌免疫反應(yīng)降低而誘發(fā)隱球菌病的發(fā)生。這為探索有效隱球菌病的途徑提供了依據(jù)。

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