冷維春,劉俊寶*,陳 鳳

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林 長春130033;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

微衛(wèi)星(microsatellite MS),廣泛分布于原核及真核生物基因組的串聯(lián)式核苷酸重復(fù)序列,具有高度多態(tài)性。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)是指由于染色體復(fù)制錯誤導(dǎo)致重復(fù)序列增加或減少表現(xiàn)為腫瘤組織與相應(yīng)正常組織DNA結(jié)構(gòu)性等位基因的大小發(fā)生改變。MSI廣泛存在于各種腫瘤組織,但未見于相應(yīng)正常組織,因此,它被認(rèn)為是繼癌基因與抑癌基因之后腫瘤分子生物學(xué)研究的新熱點。我們檢測91例卵巢癌及其對照組中微衛(wèi)星不穩(wěn)定的發(fā)生頻率,探討微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與卵巢癌的發(fā)病關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與試劑

卵巢癌組:91例均為吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦科2005-2007年收治的卵巢癌患者,均經(jīng)手術(shù)及術(shù)后病理檢查明確診斷為卵巢癌。最低年齡18歲,最高年齡75歲,平均年齡52±14.8歲。對照組:15例同期收治的卵巢良性腫瘤的病人,均無腫瘤及遺傳性疾病。15例正常人血液標(biāo)本,無腫瘤及遺傳病史。各對照組中年齡經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異無顯著性。91例卵巢癌患者Ⅰ期23例,Ⅱ期11例,Ⅲ-Ⅳ期57例。taq酶,dNTP,EB等均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

樣本蛋白酶K消化,水浴過夜后采取常規(guī)酚/氯仿提取法。

1.2.2 引物設(shè)計及PCR擴增

設(shè)計引物D7S522,擴增長度為217-229 bps;PCR擴增體系包括模板DNA 1 μ l,3'或5'端引物各0.5 μ l,dNTPs 1 μ l,PCR 緩沖液 2.5 μ l,Taq 酶 0.5 μ l,ddH2O 18 μ l,共 25 μ l。

置于PCR儀中:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸30 s,反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán),72℃終延伸 10 min。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性位點的瓊脂糖凝膠電泳鑒定及PAGE-SSCP檢測。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,溴化乙錠染色檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的發(fā)生。與自身外周血循環(huán)DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶相比,癌組織DNA微衛(wèi)星位點等位基因的擴增產(chǎn)物電泳條帶增多或減少則判為MSI。所有陽性及可疑病例均重復(fù)進(jìn)行PCR以及電泳確定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用 χ2檢驗。

2 結(jié)果

卵巢癌組PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳過程中未發(fā)現(xiàn)有條帶缺失、條帶增多、條帶遷移位置等特異性改變,見圖1。

圖1 D7S522的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

將PCR產(chǎn)物做變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析對照,發(fā)現(xiàn)部分樣本有條帶增多改變,(第1、2、5、6、7、10、11、12電泳道均有條帶增多)結(jié)果見圖2。

將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳一條帶,聚丙烯凝膠電泳出現(xiàn)多余條帶的進(jìn)行測序分析,疑有突變樣本基因測序結(jié)果登陸Genbank進(jìn)行Blast比對,Blast比對結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)有五處發(fā)生了點突變。第5位核苷酸由C變?yōu)槿笔?第12位核苷酸由C變?yōu)槿笔?第164位核苷酸由C變?yōu)锳,第181位核苷酸由C變?yōu)镚,第185位核苷酸由A變?yōu)镚。將所有疑突變樣本進(jìn)行測序比對,統(tǒng)計得出結(jié)論如下:詳見表1、表 2。

圖2 上述PCR產(chǎn)物的相對應(yīng)的聚丙烯凝膠電泳圖譜

表1 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與卵巢癌之間的關(guān)系

表2 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性發(fā)生率與卵巢癌之間的關(guān)系

3 討論

本研究對卵巢癌患者血循環(huán)DNA進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定的檢測,發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與卵巢癌的病理分期,病理類型有關(guān),微衛(wèi)星不穩(wěn)定發(fā)生在卵巢惡性腫瘤患者的循環(huán)DNA中,而卵巢良性腫瘤和正常人循環(huán)DNA中未檢測到MSI發(fā)生。馬琳[1]檢測60例原發(fā)卵巢惡性腫瘤組織的MSI,發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA序列的不穩(wěn)定性可能在卵巢惡性腫瘤尤其是特殊類型腫瘤的發(fā)生過程中起較為重要的作用,并且與卵巢惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。這與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示,MSI與病理類型有關(guān),主要發(fā)生在漿液性囊腺癌中,與卵巢癌的臨床分期有關(guān),提示MSI可能是腫瘤進(jìn)展的一種表現(xiàn)。

MSI目前認(rèn)為主要是錯配修復(fù)基因的改變[2-4],導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定,最終細(xì)胞的突變頻率增加,促發(fā)惡性腫瘤的形成。鑒于微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記的優(yōu)勢及其與特定腫瘤良好的相關(guān)性,MSI和雜合性缺失分析已成為分析基因不穩(wěn)定與腫瘤的關(guān)系及尋找新的抑癌基因的重要線索[5-7]。MSI可發(fā)生于結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤發(fā)生的早期階段或癌前病變中,也存在于錯配修復(fù)缺陷的尚未癌變的正常組織中。并且MSI與腫瘤的復(fù)發(fā)相關(guān)[8]。微衛(wèi)星位點多,在基因組中廣泛存在,長度一般較短,易于擴增。近年來對糞便、尿液、痰液、胸腹水、分泌物以及腫瘤病人血漿/血清中DNA分子異常的檢測手段日益完善、可靠。所以,MSI可望成為早期診斷部分腫瘤的分子標(biāo)志。在腫瘤中,微衛(wèi)星序列不穩(wěn)定可用來診斷某些存在錯配修復(fù)系統(tǒng)缺陷及具有遺傳性的腫瘤,同時也借助微衛(wèi)星序列不穩(wěn)定的檢測來評估腫瘤預(yù)后的好壞。

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