張彩虹,花群義*,阮周曦,楊俊興,曾少靈,陶 虹,陳 兵,曹琛福,林慶燕,周曉黎

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東深圳 518010;2.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局,云南昆明 650228)

單一引物標(biāo)記LUX熒光RT-PCR鑒別BTV和EHDV*

張彩虹1,花群義1*,阮周曦1,楊俊興1,曾少靈1,陶 虹1,陳 兵1,曹琛福1,林慶燕1,周曉黎2

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東深圳 518010;2.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局,云南昆明 650228)

采用在線LUXTM專(zhuān)業(yè)軟件,根據(jù)BTV-NS3基因序列和EHDV-NS3基因序列,通過(guò)特異性單一引物序列3′末端的熒光標(biāo)記,分別設(shè)計(jì)出兩對(duì)BTV和EHDV的LUX熒光PCR引物,并采用BLAST軟件對(duì)各引物進(jìn)行匹配性和特異性分析,根據(jù)分析結(jié)果選擇合適的引物合成。經(jīng)過(guò)各反應(yīng)條件的優(yōu)化和特異性 、敏感性試驗(yàn),并對(duì) BTV 、EHDV 、VSV、PPRV 、BVDV 、AKV 的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物和臨床樣品檢測(cè),與常規(guī)RT-PCR進(jìn)行對(duì)比檢測(cè),建立了能同時(shí)鑒別檢測(cè)BTV和EHDV的二重LUXTM熒光PCR方法。該二重LUXTM熒光PCR的BTV和EHDV各自引物只對(duì)相應(yīng)的病毒呈陽(yáng)性反應(yīng),兩者沒(méi)有交叉反應(yīng)現(xiàn)象,對(duì)健康牛、羊和豬基因組DNA、BKH-21細(xì)胞對(duì)照,以及其他幾種相似疾病如VSV、PPRV、BVDV、AKV均呈陰性反應(yīng)。該法對(duì)病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液鑒別檢測(cè)敏感性可達(dá)1TCID50C以上,比常規(guī)RT-PCR敏感性提高10倍以上,從樣品核酸純化到完成二重LUXTM熒光PCR反應(yīng)和熔解曲線分析,僅需3 h,在進(jìn)出口動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫中快速鑒別BTV和EHDV具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

LUX熒光RT-PCR;藍(lán)舌病病毒;流行性出血病病毒

藍(lán)舌病(Blue tongue)和鹿流行性出血病(Epizootic hemorrhagic disease of deer,EHD)是由庫(kù)蠓傳播的牛、綿羊等反芻動(dòng)物的2種重要?jiǎng)游锵x(chóng)媒傳染病[1-2],是動(dòng)物防疫和出入境檢疫的重要疫病。BTV和EHDV同屬呼腸病毒科環(huán)狀病毒屬的成員,這兩種病毒的結(jié)構(gòu)相似,其基因組由分為10個(gè)片段(L1-L3、M4-M6、S7-S10)的雙股 RNA 組成 ,可編碼11種病毒蛋白,其中7種為結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7),4種為非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3a和NS3b)。兩種病毒顆粒的外殼均由VP2和VP5兩種主要蛋白構(gòu)成,核芯衣殼均由VP3、VP7兩種主要蛋白和VP1、VP4、VP6三種次要蛋白構(gòu)成,其中VP2是型特異性抗原,可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,VP7和VP3具有群特異性。藍(lán)舌病病毒(BTV)已發(fā)現(xiàn)有24個(gè)血清型,鹿流行性出血病病毒(EHDV)已發(fā)現(xiàn)有8個(gè)血清型,每一個(gè)型都被認(rèn)為是一個(gè)新的病毒,因此大多數(shù)國(guó)家將它們列為外來(lái)動(dòng)物疫病[2]。這兩種疫病在臨床癥狀和病理變化上極為相似,且在多種診斷方法如瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、間接免疫熒光技術(shù)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中存在交叉反應(yīng)[2]。因此,一直以來(lái)很難對(duì)這兩種疫病進(jìn)行快速的鑒別診斷[3]。其常規(guī)的病原學(xué)診斷方法是病毒分離鑒定、免疫熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)和病毒核酸檢測(cè)等,但這些方法中,病毒分離鑒定方法操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力且存在生物安全隱患,免疫熒光標(biāo)記抗體方法存在敏感性低、特異性差,而目前的病毒核酸檢測(cè)方法只能進(jìn)行單一病原的檢測(cè)等局限性[4-5]。因此,建立一種針對(duì)BLU和EHD,在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)對(duì)二種病毒進(jìn)行快速鑒別檢測(cè)的方法,在臨床鑒別診斷和出入境動(dòng)物檢疫中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和很高的實(shí)用價(jià)值。LUX(light upon extension)熒光PCR技術(shù)是在核酸染料(如SYBR Green I)、TaqMan雙標(biāo)記熒光探針、分子信標(biāo)等熒光PCR技術(shù)之后國(guó)際上研發(fā)的一種新型實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增技術(shù)[6-8]。LUX PCR技術(shù)采用具有自身熒光淬滅功能的引物,特異性、敏感性與雙標(biāo)記探針技術(shù)相當(dāng),但成本較低。2003年以來(lái),國(guó)外已有應(yīng)用LUX PCR技術(shù)進(jìn)行核酸表達(dá)與動(dòng)植物疫病檢測(cè)研究的報(bào)道[9-11]。本研究通過(guò)基因序列分析,通過(guò)特異性單一引物序列3′末端的熒光標(biāo)記,建立一種能快速的特異性鑒別檢測(cè)BTV和EHDV的LUX實(shí)時(shí)熒光PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 藍(lán)舌病病毒(BTV)1～24型、鹿流行性出血病病毒(EHDV)1～8型和赤羽病病毒(AKV)由國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目課題組保存;VSV-NJ病毒株和VSV-IND病毒株從美國(guó)國(guó)家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室(NVSL)引進(jìn),由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存;小反芻獸疫病毒(PPRV)的RNA由英國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生研究所Pirbright實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);O型FMDV疫苗株從云南保山疫苗廠引進(jìn);牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(BVDV),由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 SSIII 1-STEP QRT-PCR 100試劑盒、SSIII 1-STEP QRT-PCR 500試劑盒、Total RNA提取試劑盒、Trizol Reagent購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;三氯甲烷、異丙醇、10 mmol/L dNTP Mixture、25 mmol/L MgCl2、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 、TaqDNA 聚合酶 、40 U/μ L RNase inhibitor(RNA 酶抑制劑)、5×RT buffer 、10×PCR buffer、150 bp DNA ladder Marker、100bp DNA ladder Marker、RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0試劑盒等均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 LUXTM引物設(shè)計(jì)及序列特異性分析 采用LUXTM專(zhuān)業(yè)軟件,根據(jù) BTV NS3基因序列和EHDV NS3基因序列,通過(guò)特異性單一引物序列3′末端的熒光標(biāo)記,分別設(shè)計(jì)LUXTM熒光PCR引物,并采用BLAST軟件對(duì)各引物進(jìn)行匹配性和特異性分析,根據(jù)分析結(jié)果選擇合適的引物。BTV下游引物5′端添加發(fā)夾形成序列,3′端標(biāo)記FAM 熒光基團(tuán);EHDV下游引物5′端添加發(fā)夾形成序列,3′端標(biāo)記JOE熒光基團(tuán)。所設(shè)計(jì)的引物:BTV-NS3上游引物 5′-ACT GAT AGC GGC GGT TGT TG-3′,下游引物 5′-CGT TAT CCG CTC ATG TCA CT T GAT AAC G-3′;EHDV-NS3 上 游引物 5′-TGA TAA TTG CGG CTG TGG TAG C-3′,下游引物5′-CG CTG CAC CCA AAT CAC TTG TCA GCG-3′。由美國(guó)Invitrogen公司合成并標(biāo)記熒光基團(tuán)。

1.2.2 病毒RNA的提取 將病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液和組織樣品研磨上清液樣品各取400 μ L,分別放入1.5 mL的無(wú)菌離心管內(nèi),加入500 μ L Trizol,充分混勻后室溫放置15 min,吹打使組織細(xì)胞破碎,加入400 μ L氯仿,振蕩混勻后,室溫放置 10 min,期間混勻兩次。在4℃下12 000 r/min離心15 min,將400 μ L上清液移至另一無(wú)菌離心管內(nèi),加入400 μ L的異丙醇,充分混勻,室溫放置 15 min。在4℃下12 000 r/min離心15 min,緩慢倒掉上清液,沿管壁緩慢加入冰冷的 750 mL/L乙醇 500 μ L,混勻后以12 000 r/min離心10 min,緩慢倒掉乙醇,管底部可見(jiàn)有乳白色RNA沉淀,小心打開(kāi)管蓋,倒扣于吸水紙上,室溫自然干燥沉淀的 RNA。加入20 μ L用DEPC處理的無(wú)菌雙蒸水溶解,用核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的純度和濃度,直接用于反轉(zhuǎn)錄或置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 BTV和EHDV二重LUX熒光PCR反應(yīng)體系的建立 采用25 μ L反應(yīng)體積,通過(guò)對(duì)退火溫度和時(shí)間、引物和鎂離子濃度等試劑組合與反應(yīng)條件進(jìn)行一系列比較試驗(yàn)和優(yōu)化,建立二重反應(yīng)體系如下:25 μ L反應(yīng)混合液含 12.5 μ L UDG 緩沖液(Invitrogen cat.11730-017),4 mmol/L Mg2+,BTV上、下游引物各200 nmol/L,EHDV上、下游引物各100 nmol/L,25 mmol/L ROX 染料0.5 μ L,核酸樣品5 μ L;在ABI 7500熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,PCR條件為:50℃2 min,95℃2 min;然后95℃15 s,65℃40 s,35個(gè)循環(huán),在65℃反應(yīng)時(shí)采集熒光信號(hào);熔解曲線循環(huán)條件采用95℃15 s,60℃30 s,96℃15 s。反應(yīng)結(jié)束,根據(jù)擴(kuò)增曲線、Ct值和熔解曲線判定結(jié)果。BTV的反應(yīng)結(jié)果在FAM通道檢測(cè),EHDV的檢測(cè)結(jié)果在JOE通道檢測(cè)。

1.2.4 常規(guī) RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)基因庫(kù)提供的BTV和EHDV各基因的序列,通過(guò)Blast分析軟件分別對(duì)基因的序列進(jìn)行分析,選擇了高度保守和特異性強(qiáng)的區(qū)段,應(yīng)用計(jì)算機(jī) Primer軟件設(shè)計(jì)了BTV VP7基因、EHDV VP7基因2對(duì)特異性引物,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物的序列如下:BTV上游引物:5′-CT T CTT GAA ACT GAG GAA ACC T T-3′,下游引物:5′-AT T TGC ACC ATC GCA T TC TG-3′;EHDV 上游引物 :5′-CCA GAA TGT TAC TAC ATC AAT CGT ATC CT-3′,下游引物:5′-GGC GCC AAT ACG ATA AAG G-3′。RT-PCR 反應(yīng)體系采用50 μ L 反應(yīng)體積,具體按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。循環(huán)條件如下:50℃30 min,94℃2 min;然后94℃45 s,55℃45 s,72℃1 min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃5 min。通過(guò)常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳和GoldviewTMDNA染料染色檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。BTV擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為351 bp,EHDV擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為537 bp。

1.2.5 BTV和EHDV二重LUX熒光RT-PCR特異性試驗(yàn) 采用一步法 LUX熒光PCR方法,采用引物濃度優(yōu)化后的二重 LUX PCR最佳反應(yīng)條件,按照 1.2.3建立的反應(yīng)體系,分別以 BTV1、BTV10、BTV17 、EHDV1 、EHDV2 、EHDV5 、VSVNJ、AKV、FMDV 、PPRV 、BVDV 等 的 RNA 和BHK-21細(xì)胞總RNA為模板,用2對(duì)引物混合液進(jìn)行LUXTM熒光PCR,以驗(yàn)證LUXTM熒光 PCR的特異性。

1.2.6 BTV和EHDV二重LUXTM熒光PCR鑒別檢測(cè)的敏感性試驗(yàn) 制備幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21),長(zhǎng)成單層后,棄上清營(yíng)養(yǎng)液,用無(wú)血清的維持液洗2次,分別接種BTV和EHDV,37℃吸附1 h,換維持液,于37 ℃培養(yǎng),當(dāng)出現(xiàn)75%細(xì)胞病變(CPE)時(shí),收獲病毒、離心,凍存于-70℃。然后按照Karber氏法測(cè)定病毒毒價(jià)(TCID50),BTV和EHDV的TCID50測(cè)定結(jié)果均為 10-7TCID50/50 μ L。用維持液將病毒液稀釋成不同滴度,每個(gè)稀釋度各取50 μ L,按1.2.2提取核酸后,采用二重 LUX 熒光PCR最佳反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增,以評(píng)估檢測(cè)二種病毒的敏感性。同時(shí)取10 μ L進(jìn)行常規(guī)二重PCR檢測(cè),比較熒光PCR和常規(guī)PCR的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 BTV和EHDV二重LUX熒光PCR最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)反轉(zhuǎn)錄溫度和時(shí)間、PCR擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度和時(shí)間、引物和鎂離子濃度等試劑組合與反應(yīng)條件的比較試驗(yàn)和優(yōu)化,確定最佳反應(yīng)條件為:反轉(zhuǎn)錄50℃15 min,熒光 PCR循環(huán)條件為 95℃2 min,然后95 ℃15 s,65 ℃40 s,循環(huán)數(shù)為40;熔解曲線的循環(huán)條件采用95℃15 s,55℃1 min,95℃15 s。在同一個(gè)反應(yīng)管中有BTV和 EHDV兩種病毒的 RNA和各自的引物。結(jié)果顯示,BTV和EHDV分別在FAM和JOE通道檢測(cè)到典型的擴(kuò)增信號(hào),熔解曲線分析結(jié)果顯示BTV在80℃出現(xiàn)明顯的吸收峰,EHDV在82℃出現(xiàn)明顯的吸收峰。說(shuō)明如果樣品中存在 BTV和 EHDV兩種病毒,該反應(yīng)體系可在同一管中可同時(shí)鑒別檢測(cè)到兩種病毒核酸(圖1)。

圖1 BTV和EHDV二重LUX熒光PCR結(jié)果Fig.1 T he result of two-color multiplex LUXTMreal-time PCR for BT V and EHDV

2.2 BTV和EHDV二重LUX熒光PCR的特異性試驗(yàn)

采用已優(yōu)化的BTV和EHDV二重LUX熒光PCR 反應(yīng)條件,設(shè)立BTV 、EHDV 、VSV-NJ、AKV 、FMDV、PPRV、BVDV等病毒的 RNA和BHK-21細(xì)胞總 RNA為模板,用兩對(duì)引物混合液進(jìn)行LUXTM熒光PCR,驗(yàn)證LUXTM熒光PCR的特異性。結(jié)果顯示,在FAM通道,只有BTV樣品呈典型的陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng),而 EHDV、VSV、AKV、FMDV、PRRV、BVDV等病毒對(duì)照和BHK-21細(xì)胞對(duì)照均呈陰性反應(yīng);而在JOE通道,只有EHDV均呈陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng),其他病毒對(duì)照和BHK-21細(xì)胞對(duì)照呈陰性反應(yīng)。熔解曲線結(jié)果與擴(kuò)增曲線分析結(jié)果一致。說(shuō)明BTV和EHDV二重LUX熒光PCR的特異性強(qiáng),BTV和EHDV之間無(wú)交叉反應(yīng),與其他相關(guān)或相似病毒也無(wú)交叉反應(yīng)現(xiàn)象(圖2和圖3)。

圖2 BTV LUX熒光PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The result of L UXTMreal-time PCR specific test for BT V

圖3 EHDV LUX熒光PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 T he result of LUXTMreal-time PCR specific test fo r EHDV

2.3 BTV和EHDV二重LUX熒光PCR敏感性試驗(yàn)

根據(jù)BTV和EHDV病毒毒價(jià)測(cè)定結(jié)果,用維持液將病毒原液做10倍系列稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8,相當(dāng)于稀釋成 10 ×106、10 ×105、10 ×104、10 ×103、10 ×102、10,1、0.1 TCID50,每個(gè)稀釋度各取50μ L提取病毒核酸,采用已優(yōu)化的BTV和EHDV二重LUX熒光PCR反應(yīng)條件,進(jìn)行BTV和EHDV二重LUX熒光PCR敏感性試驗(yàn)。LUX熒光PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,BTV和EHDV病毒液的檢測(cè)靈敏度分別為10-6和10-7,分別相當(dāng)于10個(gè)TCID50和1個(gè)TCID50。而常規(guī)RTPCR對(duì)同一批樣品的檢測(cè)靈敏度分別為 10-5和10-6,LUX熒光PCR檢測(cè)方法的敏感性比常規(guī)RTPCR至少高10倍(圖4和圖5)。

圖4 BTV LUX熒光PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The result of LUXTMreal-time PCR sensitivity test fo r BT V

圖5 EHDV LUX熒光PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 T he result of LUXTMreal-time PCR sensitivity test for EHDV

2.4 對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用BTV和EHDV二重LUX熒光 PCR,對(duì)32份BTV1～24型和EHDV1～8型病毒的不同時(shí)期的 BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)液樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果BTV1～24型病毒均在FAM通道檢測(cè)到典型的擴(kuò)增信號(hào),熔解曲線分析時(shí)在80℃出現(xiàn)明顯的吸收峰;EHDV1～8型病毒均在JOE通道檢測(cè)到典型的擴(kuò)增信號(hào),熔解曲線分析時(shí)在82℃出現(xiàn)明顯的吸收峰。說(shuō)明該方法對(duì)各型BTV和EHDV的檢測(cè)具有通用性和特異性。

3 討論

本研究采用一種新型的分子生物學(xué)檢測(cè)方法,通過(guò)特異性單一引物3′末端的熒光標(biāo)記,建立了一種快速的能在同一管內(nèi)對(duì)BTV和EHDV進(jìn)行快速鑒別檢測(cè)的LUX實(shí)時(shí)熒光PCR方法。

BTV和EHDV的結(jié)構(gòu)非常相似,核酸序列差異較小,因此在設(shè)計(jì) LUX熒光PCR引物時(shí)既要考慮選取片段的保守性,又要求這兩種病毒的核酸序列差異明顯。有研究發(fā)現(xiàn),EHDV編碼NS3蛋白的核酸片段10有群特異性,在血清型1和2之間較為保守,同源性為96.3%,而與其他環(huán)狀病毒屬的成員差異較大,如與多種血清型的BTV的相似性較低,在51.4%～54.4%之間,與非洲馬瘟3型的相似性?xún)H為27.2%[2,5]。因此,本研究在設(shè)計(jì) LUX熒光PCR引物時(shí),選用NS3基因作為目標(biāo)檢測(cè)基因。單模板的二重LUX熒光PCR檢測(cè)結(jié)果證明,這兩對(duì)引物特異性好,EHDV引物對(duì)只對(duì)EHDV樣品呈陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng),而與BTV、VSV、AKV等樣品呈陰性反應(yīng);BTV引物對(duì)只對(duì)BTV樣品呈陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng),而與EHDV、VSV、AKV等樣品呈陰性反應(yīng)。

在熒光PCR反應(yīng)中,對(duì)結(jié)果的判定往往是依據(jù)Ct值和有無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線,由于引物二聚體有時(shí)也會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào),出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,因此可能會(huì)影響結(jié)果的判定[9,12]。本研究方法在PCR擴(kuò)增反應(yīng)后,加入熔解曲線的擴(kuò)增反應(yīng),由于特定擴(kuò)增產(chǎn)物只在特定溫度解鏈并出現(xiàn)特異吸收峰,從而可以排除非特異性擴(kuò)增引起的干擾。但是由于儀器本身的原因,分析熔解曲線結(jié)果時(shí),無(wú)法對(duì)兩種病毒在同一界面上進(jìn)行分析,每次分析只能選擇一個(gè)檢測(cè)通道的樣品。BTV和EHDV的LUX熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果顯示,BTV的特異性吸收峰約出現(xiàn)在80℃,而EHDV的特異性吸收峰約出現(xiàn)在82℃。此外,在BTV和EHDV的LUX熒光PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn),熔解曲線結(jié)果中樣品的特異性吸收峰的峰值高低與PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果中該樣品的熒光增量大小有關(guān),而與樣品的濃度無(wú)關(guān),熒光增量越大,吸收峰的峰值越高。樣品吸收峰的峰值高低是按照擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果中樣品的熒光增量的大小來(lái)排列的,因此在熔解曲線圖中樣品的稀釋度排列呈現(xiàn)不規(guī)則的現(xiàn)象。這也說(shuō)明熔解曲線分析可以進(jìn)一步保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在BTV和EHDV的二重LUX熒光PCR敏感性試驗(yàn)中,本研究分別采用了單模板和雙模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。LUX熒光PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,不管是單模板還是雙模板混樣測(cè)試,對(duì)檢測(cè)的最低靈敏度沒(méi)有影響,但是在混樣測(cè)試中發(fā)現(xiàn),具有擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)的樣品會(huì)影響另外一個(gè)樣品擴(kuò)增的熒光增量和熔解曲線特異性吸收峰峰值的大小。

本研究所建立的二重LUX熒光PCR方法從樣品的核酸提取到熒光PCR反應(yīng)和熔解曲線分析結(jié)束,約需2 h～3 h,比起傳統(tǒng)的病毒分離方法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。且本方法檢測(cè)對(duì)象是病毒的核酸片段,即使樣品中的病毒失活也不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果,從而可以提高樣品的檢出率,這在進(jìn)出境動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫中具有實(shí)際應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。與常規(guī)RT-PCR相比,LUX熒光PCR的檢查靈敏度提高了10倍。

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Simultaneous Detection and Differentiation of Bluetongue and Epizootic Hemorrhagic Disease Viruses Using Multiplex LUX Real-time PCR

ZHANG Cai-hong1,HUA Qun-yi1,RUAN Zhou-xi1,YANG Jun-xing1,ZENG Shao-ling1,TAO Hong1,CHEN Bing1,CAO Chen-fu1,LIN Qing-yin1,ZHOU Xiao-li2

(1.Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen,Guangdong,518010,China;2.Y unnan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,K unming,Yunnan,650228,China)

A real-time reverse transcriptase(RT)-PCR assay,applying light upon extension(LUX)fluorogenic primers,was developed for rapid detection and identification of bluetongue virus(BTV)and epizootic hemorrhagic disease virus(EHDV).The LUX primers were designed based on the NS3 gene sequence of BTV and EHDV respectively.The assay described here was designed to allow simultaneous detection of BTV and EHDV in a multiplex format.The detection limit of the assay was approximately 10TCID50and 1TCID50for BTV and EHDV respectively.Comparison tests indicated that the LUX real-time RT-PCR assay had at least ten-fold increase of sensitivity than the gel-based RT-PCR method.The real-time PCR assay could differentiate BTV and EHDV from other related disease viruses,such as VSV,PPRV,BVDV,AKV.The whole procedure,including RNA extraction,real-time amplification and dissociation analysis,can be completed within 3 hours.Due to its high specificity,sensitivity,and relative simplicity,the LUX RT-PCR assay provides a novel,rapid,and practical tool for the identification detection and of BTV and EHDV.

LUX real-time RT-PCR;Bluetongue virus;Epizootic hemorrhagic disease virus

S852.659.4

A

1007-5038(2010)03-0006-06

2009-09-28

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z445)

張彩虹(1980-),女,河北邯鄲人,獸醫(yī)師,主要從事動(dòng)物檢疫和診斷方法研究。*通訊作者