曾少靈,林慶燕,花群義,張彩虹,阮周曦,楊俊興,孫 潔,秦智鋒,曹琛福,陳 兵,呂建強(qiáng)

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植中心,廣東深圳 518010)

PRRSV云南A06株ORF5和ORF7基因的克隆與序列分析*

曾少靈,林慶燕,花群義*,張彩虹,阮周曦,楊俊興,孫 潔,秦智鋒,曹琛福,陳 兵,呂建強(qiáng)

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植中心,廣東深圳 518010)

設(shè)計(jì)2對(duì)引物分別擴(kuò)增PRRSV的ORF5和ORF7基因,對(duì)從云南某豬場(chǎng)分離到的毒株A06進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),得到2條特異性擴(kuò)增帶,克隆至pMD18-T載體并測(cè)序。將A06株的ORF5和ORF7基因及其推斷氨基酸序列分別與PRRSV歐洲型代表株LV、美洲型代表株VR 2332和7株中國(guó)分離的美洲型毒株相應(yīng)基因進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)分析。結(jié)果顯示,A06株屬于美洲型,其ORF5和ORF7基因及推斷氨基酸與我國(guó)2006年分離的4株HP-PRRSV代表株的相似性高達(dá)98%～99%,與歐洲型代表株LV的相似性只有56%～64%。分別構(gòu)建了以上毒株ORF5和ORF7基因的親緣關(guān)系圖譜,反映了A06株ORF5和ORF7基因的進(jìn)化位置,完成2個(gè)基因的遺傳變異分析。

PRRSV;ORF5基因;ORF7基因;親緣關(guān)系圖譜

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),俗稱豬藍(lán)耳病。目前,世界上流行的PRRSV基因型主要有以LV株為代表的歐洲型和以VR2332株為代表的美洲型。過去,PRRS在我國(guó)各省市均有不同程度的發(fā)生,2006年我國(guó)部分地區(qū)還暴發(fā)了高致病性豬藍(lán)耳病,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

PRRSV是單股正鏈 RNA病毒,基因組長(zhǎng)約15 kb,含有ORF1a、ORF1b和ORF2～7共 8個(gè)開放閱讀框[3-5]。其中,ORF5基因全長(zhǎng)603 bp,編碼糖基化囊膜蛋白GP5,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體,因此很多PRRS新型疫苗均以GP5為靶抗原進(jìn)行研制[4]。ORF7基因全長(zhǎng)372 bp,編碼核衣殼蛋白N,是病豬最先產(chǎn)生的抗體,抗體存在持續(xù)半年,因此無論在感染早期還是晚期都可作為PRRSV抗體的檢測(cè)抗原,具有重要的診斷學(xué)意義[3-5]。

本文從某豬場(chǎng)病料中分離的PRRSV毒株A06中擴(kuò)增得到2個(gè)特異性片段,克隆至pMD18-T載體,經(jīng)測(cè)序,表明分別源自 PRRSV的 ORF5和ORF7基因。基因序列和推斷氨基酸序列分析表明,A06株屬于美洲型PRRSV,同時(shí)構(gòu)建了這2個(gè)基因的親緣關(guān)系圖譜 ,反映了A 06株ORF 5和ORF7基因的進(jìn)化位置。而研究某地流行毒株的基因變異情況,才能有效地選擇適合當(dāng)?shù)氐亩局曛苽湟呙绾褪┬杏行У拿庖叱绦?對(duì)于有效預(yù)防和控制當(dāng)?shù)豍RRSV的發(fā)生和傳播,具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒(菌)株與質(zhì)粒 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室從云南某豬場(chǎng)豬病料中分離到的PRRSV毒株A06,為本室保存。質(zhì)粒pMD18-T為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品,大腸埃希菌轉(zhuǎn)化受體菌JM101為本室保存。

1.1.2 試劑 病毒RNA/DNA快速純化試劑盒、一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、pMD18-T克隆載體連接試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒和DNA標(biāo)準(zhǔn)等生化試劑均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)合成。DNA測(cè)序由寶生物工程(大連)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 在GenBank上搜集并下載PRRSV多個(gè)毒株的ORF5和ORF7基因序列,經(jīng)分析比較,選擇兩個(gè)基因相對(duì)保守的首尾序列及其鄰近序列,利用軟件DNA Star中的Primer Select設(shè)計(jì)引物。

1.2.2 目的基因片段的擴(kuò)增與回收 使用病毒RNA/DNA快速純化試劑盒提取病毒RNA。使用一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,以15 g/L瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的擴(kuò)增片段。

1.2.3 基因的克隆與測(cè)序 將回收的目的擴(kuò)增片段連接到pMD18-T載體上,按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》完成轉(zhuǎn)化與重組菌篩選培養(yǎng)等步驟[6]。使用質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒提取重組質(zhì)粒,并送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 基因序列與推斷氨基酸序列分析 測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blaster分析,由基因序列得到的推斷氨基酸序列在 Expasy網(wǎng)站上利用Prot-Param工具進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析[7-8]。

1.2.5 基因親緣關(guān)系圖譜的構(gòu)建 在GenBank上收集PRRSV有關(guān)代表株與這些代表株的ORF5和ORF7基因序列和推斷氨基酸序列,利用DNA Star中Meglign軟件排列比對(duì),選擇Clustal V Method進(jìn)行計(jì)算,分別構(gòu)建ORF5和ORF7基因的親緣關(guān)系圖譜[7-8]。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增全長(zhǎng)ORF5基因和ORF7基因的引物

本文設(shè)計(jì)了一對(duì)引物 PRRSV-GP5-F和PRRSV-GP5-R擴(kuò)增ORF5基因的完整讀碼框,序列為 5′-ATGT TGGGGAAGTGCTTGACCGC-3′和5′-CTAGAGACGACCCCAT TGTTC-3′。 另 一 對(duì)引物PRRSV-N-F和PRRSV-N-R擴(kuò)增ORF7基因的完整讀碼框,序列為 5′-ATGCCAAATAACAACGGCAAGCAGC-3′ 和 5′-TCATGCTGAGGGTGATGCTGGGG-3′。

2.2 目的基因的擴(kuò)增

以引物對(duì) PRRSV-GP5-F和 PRRSV-GP5-R、PRRSV-N-F和 PRRSV-N-R分別對(duì)毒株 A06的RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),以15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,可見2條與預(yù)期大小一致的特異性條帶(圖1)。

圖1 PRRSV A06株ORF5基因和ORF7基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of RT-PCR amplification of ORF5 gene and O RF7 gene from PRRSV isolate A06

2.3 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果與序列分析

回收上述陽性擴(kuò)增片段,分別連接到pMD18-T載體上,得到重組質(zhì)粒PRRSV-A06-GP5-pMD18T和PRRSV-A06-N-pMD18T,送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定,結(jié)果如圖2(A,B)。表明克隆到pMD18-T載體上的基因大小分別為603 bp和372 bp,經(jīng)NCBI的Blaster分析確定,2個(gè)基因均源自 PRRSV,分別與已報(bào)道的 PRRSV ORF5和ORF7基因有很高的同源性。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果推斷A06株ORF5和ORF7基因的氨基酸序列,在Expasy網(wǎng)站上利用Prot Param工具對(duì)推斷氨基酸進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析。結(jié)果表明,A06的GP5和N蛋白應(yīng)具有良好穩(wěn)定性,GP5蛋白親水性良好,具備充當(dāng)跨膜蛋白的條件,而N蛋白基本沒有親水性,預(yù)計(jì)不具有跨膜功能。

圖2 PRRSV毒株A06 ORF5基因(A)和ORF7基因(B)的測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing result of ORF5 gene(A)and ORF7 gene(B)from PRRSV isolate A06

2.4 ORF5和ORF7基因與推斷氨基酸序列比對(duì)與相似性分析結(jié)果

在EBI網(wǎng)站上完成PRRSV A06株與其他9個(gè)PRRSV毒株之間的ORF5和ORF7核苷酸序列與推斷氨基酸序列的相似性比較,相似比例的結(jié)果見表1。在A06株的ORF5和ORF7基因及推斷氨基酸與我國(guó)2006年分離到的4株HP-PRRSV代表株的ORF5和ORF7基因的相似性高達(dá)98%～99%,與疫苗株pMLV、經(jīng)典中國(guó)代表株的相似性達(dá)87%～95%,與美洲型代表株VR-2332的相似性達(dá)89%～95%,而與歐洲型代表株 LV的相似性只有56%～64%,表明A06株屬于美洲型,且與中國(guó)本土PRRSV毒株相比更接近于2006年中國(guó)高致病性PRRSV毒株系列。

表1 PRRSV A06株與其他9個(gè)毒株之間的ORF5和ORF7核苷酸序列及氨基酸序列相似性比較Table 1 Similarity comparisons of the sequences of nucleotide and deduced amino acids of ORF5 and ORF7 genes from PRRSV isolate A06 with the other 9 P RRSV isolates

PRRSV A06株與其他9個(gè)PRRSV毒株之間的ORF5核苷酸和推斷氨基酸序列的排列比對(duì)結(jié)果顯示,10株P(guān)RRSV的ORF5基因在第70位～82位、111位～117位、171位 ～175位、442位 ～447位、550位～556位及593位～600位核苷酸序列有明顯差異,但氨基酸變異則主要集中在N端信號(hào)肽序列及臨近高變區(qū)(第3位～40位氨基酸)。

PRRSV A06株與其他9個(gè)PRRSV毒株之間的ORF7核苷酸和推斷氨基酸序列的排列比對(duì)結(jié)果顯示,歐洲型代表株LV缺失第90位～97位和104位～106位堿基,其他9株P(guān)RRSV的ORF7缺失第26位～34位、135位～136位以及末尾序列的多個(gè)堿基。此外,10株P(guān)RRSV的ORF7在第116位～120位、216位～220位、268位～ 271位、280位～285位、302位～306位及323位～329位核苷酸序列有明顯差異,但沒有導(dǎo)致10個(gè)毒株ORF7氨基酸組成的重大差異,僅是LV株缺失第37位～39位氨基酸,其他9株缺失第13位～16位氨基酸,說明不同來源株的ORF7氨基酸組成相對(duì)保守,與PRRSV中ORF7編碼的N蛋白的有關(guān)報(bào)道一致。

2.5 A06株ORF5和ORF7基因親緣關(guān)系圖譜的構(gòu)建

利用DNAStar中Meglign軟件排列比對(duì)10個(gè)PRRSV毒株的 ORF5和 ORF7基因序列,選擇Clustal V Method進(jìn)行計(jì)算,分別構(gòu)建了ORF5和ORF7基因的親緣關(guān)系圖譜,如圖3和圖4。圖譜表明,歐洲型代表株LV與其他毒株的距離都很遠(yuǎn),為單獨(dú)一群。A06株與美洲型代表株VR 2332關(guān)系較近,屬于美洲型。國(guó)內(nèi)美洲型分離株明顯分為兩個(gè)亞群,第一亞群以2006年HP-PRRSV為主,第二亞群以早年分離到的中國(guó)經(jīng)典代表株和疫苗株為主。A06株ORF5、ORF7基因與2006年在我國(guó)暴發(fā)的高致病性 PRRSV 系列株 HEB1、HUB2、HUN4、JXA1關(guān)系密切,屬同一個(gè)亞群,而與中國(guó)經(jīng)典代表株CH-1a和BJ-4、中國(guó)疫苗株pMLV分屬于國(guó)內(nèi)美洲型分離株的兩個(gè)亞群。

圖3 10株P(guān)RRSV分離株ORF5基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of ORF5 gene from 10 P RRSV isolates

圖4 10株P(guān)RRSV分離株ORF7基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of ORF7 gene from 10 P RRSV isolates

3 討論

自從豬繁殖與呼吸綜合征在20世紀(jì)80年代末發(fā)生以來,該病相繼在各國(guó)呈流行性感染,已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5,8]。盡管多個(gè)國(guó)家已采用定期監(jiān)測(cè)、注射疫苗等形式加強(qiáng)預(yù)防,但是該病仍陸續(xù)暴發(fā),甚至出現(xiàn)了更多的高毒株系,而造成該病難以防控的其中一個(gè)重要原因是PRRSV 的變異[9-10]。據(jù)報(bào)道,PRRSV可通過堿基突變、缺失[8]和基因重組[11]等方式發(fā)生變異,產(chǎn)生適應(yīng)性更好、毒性更高的新毒株[12]。

而在PRRSV中,ORF5基因最容易發(fā)生變異[8]。由其編碼的GP5蛋白是PRRSV所有結(jié)構(gòu)蛋白中具有較強(qiáng)抗原性的蛋白,不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生與病毒的中和反應(yīng)呈顯著相關(guān)的中和抗體,還在引起特異性細(xì)胞免疫、阻止肺泡巨噬細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用[12]。因此,ORF5基因的變異,引起其編碼的GP5蛋白的變化,帶來抗原性的改變,最終導(dǎo)致 PRRSV相關(guān)特性的改變[8]。這可能是免疫豬群不能抵抗變異毒株攻擊而發(fā)病的原因之一[8]。與ORF5相比,ORF7基因相對(duì)保守,其編碼的N蛋白是PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中含量最高的蛋白,也是免疫原性最強(qiáng)的蛋白,是體液免疫應(yīng)答的主要抗原,成為目前PRRSV血清學(xué)診斷方法的抗原基礎(chǔ),也是PRRSV抗原分型和基因分型的主要依據(jù)[3-5]。

本試驗(yàn)從PRRSV毒株A06中克隆到ORF5和ORF7基因,根據(jù)基因序列,推導(dǎo)了A06株ORF5和ORF7基因編碼的GP5和N蛋白的氨基酸序列,與PRRSV歐洲型代表株LV、美洲型代表株VR 2332和多個(gè)中國(guó)代表株進(jìn)行了核苷酸和氨基酸序列比對(duì)分析、蛋白特性分析和功能預(yù)測(cè),完成了A06株ORF5和ORF7基因與上述毒株相應(yīng)基因的親緣關(guān)系圖譜分析,確定了A06株ORF5和ORF7基因進(jìn)化的相對(duì)位置,為我國(guó)PRRSV毒株資料信息庫(kù)補(bǔ)充了新的材料。

不同毒株的PRRSV具有不同的抗原性,這不僅表現(xiàn)在歐洲株和美洲株之間,即使是美洲株之間也存在差異[7-8]。因此,及時(shí)收集、分析和研究當(dāng)?shù)亓餍卸局甑幕蜃儺惽闆r,選擇與當(dāng)?shù)亓餍卸局暝诳乖陨舷嚓P(guān)的種毒進(jìn)行疫苗制備,施行因時(shí)因地制宜的疫苗免疫接種程序,對(duì)于有效預(yù)防和控制當(dāng)?shù)豍RRSV的發(fā)生和傳播,具有重要意義。

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Cloning and Sequence Analysis of ORF5 and ORF7 Genes from PRRSV Isolate A06

ZENG Shao-ling,LIN Qing-yan,HUA Qun-yi,ZHANG Cai-hong,RUAN Zhou-xi,YANG Jun-xing,SUN Jie,QIN Zhi-feng,CAO Chen-fu,CHEN Bing,L¨U Jian-qiang

(Animals and Plants Inspection and Quarantine Institute,Shenzhen Entry-Exit Inspection&Quarantine Bureau,Shenzhen,Guangdong,518010,China)

Two pairs of primers were designed to amplify the complete ORF5 and ORF7 genes from PRRSV isolate A06 by RT-PCR.The ORF5 and ORF7 genes from isolate A06 were cloned to pMD18-T vector and sequenced,respectively.Comparison of the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of ORF5 and ORF7 genes from isolate A06 with isolate LV,VR 2332,and 7 isolates from China indicated that isolate A06 was clustered within American genotype.The ORF5 and ORF7 genes and their deduced amino acid of isolate A06 showed high homology of 98%-99%to 4 strains of HP-PRRSV which were isolated homeland in 2006,but genetically distinct from isolate LV with a low homology of 56%-64%.The phylogenetic trees of ORF5 and ORF7 genes were set up to show the evolution situation of isolate A06 among the isolates in this study.

PRRSV;ORF5 gene;ORF7 gene;phylogenetic tree

S852.659.6;Q785

A

1007-5038(2010)03-0012-06

2009-08-21

國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2008IK262-2);深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目(SZ2007038)

曾少靈(1977-),女,廣東人,碩士研究生,主要從事病毒分子生物學(xué)研究。*通訊作者