張 玲,包靜月,李 林,王志亮*

(1.青島農業(yè)大學動物科技學院,山東青島 266109;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心國家外來動物疫病診斷中心,山東青島 266032)

RT-PCR鑒別小反芻獸疫病毒疫苗株與強毒株方法的建立

張 玲1,2,包靜月1,李 林1,王志亮1*

(1.青島農業(yè)大學動物科技學院,山東青島 266109;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心國家外來動物疫病診斷中心,山東青島 266032)

根據(jù)GenBank中公布的小反芻獸疫病毒的H基因或全基因序列,利用軟件Primer Premier 5.0設計引物,擴增片段長度為477 bp,建立區(qū)分小反芻獸疫疫苗毒與基因4系野毒的RT-PCR檢測方法,并用于臨床檢測。結果表明,建立的RT-PCR鑒別診斷方法能特異性區(qū)分疫苗株Nigeria 75/1與基因4系PPRV,與基因3系、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒等同屬病毒無交叉反應;最低可以檢測到濃度為7.7×10-5ng/μ L的RNA模板;該方法操作簡單,耗時短,可以初步用于臨床鑒別診斷。

RT-PCR;鑒別;小反芻獸疫病毒

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(PPRV)引起的發(fā)生于山羊和綿羊的一種以發(fā)熱、口腔壞死性內膜炎、腸炎、高發(fā)病率和高死亡率為特征的急性接觸性傳染病。PPR病毒是副黏病毒科(Paramy xoviridae)麻疹病毒屬(Morbolivirus)成員,同屬的其他成員還有牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV),犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV),海豹瘟病毒(Porpoise distemper virus,PDV)[1-3]。PPRV是聯(lián)合國糧農組織(FAO)和世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須報告的傳染病,我國規(guī)定為一類動物疫病。山羊和綿羊是PPR的惟一自然宿主,山羊比綿羊更易感,且臨床癥狀比綿羊更為嚴重,具有極高的發(fā)病率和死亡率,野生小反芻動物也可感染發(fā)病死亡,目前尚無人感染該病的報告。PPR一旦暴發(fā),將會給國家的小反芻獸的國內流動和國際貿易,同時對相關的動物制品如羊毛,羊絨,羊皮等產品的出口帶來困難,從而給國家和農牧民造成巨大的經濟損失[4-5]。PPRV只有一個血清型,從遺傳演化上,可分為四個基因系,基因1系分布在西非;基因2系分布在非洲北部的尼日利亞,喀麥隆;基因3系主要分布在東非;基因4系主要分布在中東和西亞?？梢哉J為該病毒在漫長的由西部向東部傳播過程中,亞型發(fā)生著從1-2-3-4的轉變[6-7],我國西藏阿里地區(qū)流行的毒株均為4系,與周邊國家一致[8]。

目前對于小反芻獸疫尚無有效的治療方法,主要還是依靠疫苗免疫防控。1989年,通過在Vero細胞上的連續(xù)傳代,成功將Nigeria75/1株致弱。試驗證明Nigeria75/1株能誘導機體產生針對PPRV的抗體,有效預防PPRV強毒的感染,對羊沒有副作用,并且保護性抗體可以持續(xù)3年以上。雖然Nigeria75/1株屬于基因2系毒株,但對其他3個系的強毒同樣具有高的保護率[9]。我國西藏地區(qū)發(fā)生小反芻獸疫后,對疫區(qū)及周邊地區(qū)進行免疫接種的疫苗均為小反芻獸疫弱化毒株Nigeria75/1[10]。該疫苗為我國乃至全世界的小反芻獸疫的控制做出了重要的貢獻。但是弱毒株的存在會干擾PPR的血清學調查,導致無法與野毒感染進行區(qū)分。近年來應用RT-PCR、PCRELISA等檢測方法,對小反芻獸疫病毒進行快速檢測并且區(qū)分PPR和RP的診斷方法早有報道,但是這些檢測方法都不能鑒別區(qū)分野毒和疫苗毒。本試驗建立了區(qū)分疫苗毒和基因4系野毒株的RT-PCR方法,希望能夠為將來的小反芻獸疫病毒的檢測提供積極有效的技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與病料 所用毒株有3系Sudan/sinar株,Oman/Dorccs株,基因4系 Turkey/2000株,Indian/Taylor/LN株,RPV/RBOK株,RPV/Russian株均為英國動物衛(wèi)生Pirbright實驗室 Tom Barrette教授惠贈。Nigeria75/1、CDV、PPRV/China/Tibet/07分離株均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心國家外來疫病診斷中心保存。西藏阿里地區(qū)送檢的臨床RNA樣品29份(-70℃保存?zhèn)溆?。

1.1.2 試劑 One step prime script RT-PCR kit DNA Marker均為寶生物工程(大連)有限公司產品;Trizol reagent為Invitrogen公司產品;DEPC為Sigma公司產品。其余試劑均有國產或進口的分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參照GenBank中公布的關于PPRV的H基因序列或全基因序列,利用Meg A-lign(DNA Star),Primer Premier 5.0軟件在H基因變異性最大的區(qū)域設計一對特異性引物 H1a/H2b。擴增片段的長度為477 bp。由寶生物工程(大連)有限公司合成。DEPC處理過的水溶解至100 μ L 。

PPRVH1a:CCT GGA TAG AGA ACG CT T GGTC;PPRVH2b:CCG AGA GTC AAT GAT TGC AGCT。

1.2.2 RT-PCR擴增條件的優(yōu)化 RT-PCR反應體系(25 μ L)如下:2 ×1 step buffer 12.5 μ L,1 μ L正向引物為 PPRV H1a(10 μ mol/L),1 μ L 反向引物為 PPRV H2b(10 μ mol/L),1 μ L Prime script Enzyme Mix,6.5 μ L RNA Enzyme Free H2O,模板RNA 3 μ L。擴增和檢測反應條件為:50 ℃,30 min進行反轉錄;94℃,2 min進行Taq酶激活;94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,40個循環(huán);72℃7 min延伸。擴增反應后用15 g/L的瓊脂糖凝膠進行核酸電泳,觀察片段大小。

1.2.3 靈敏度試驗 取200 μ L China/Tibet/07感染的Vero細胞,提取 RNA。用Nano Drop(ND1000 Spectrophotometer)濃度測定儀確定其濃度為77 ng/μ L,然后按 10 倍遞增稀釋至 10-7ng/μ L,反轉錄后,用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.2.4 特異性試驗 以China/Tibet/07株,Turkey/2000株,Indian/Taylor/LN株,Sudan/sinar株,Oman/Dorccs株,RPV/RBOK株,RPV/Russian株及CDV的RNA為模板,DEPC水為空白對照,Vero細胞為陰性對照。用引物H1a/H2b進行PCR擴增。結束后用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.2.5 樣品檢測 調整上述PCR反應中的擴增條件,摸索出該引物的最適合條件。然后對西藏阿里地區(qū)送檢的來自29頭疑似發(fā)病羊的29份組織的核酸樣品進行檢測。用本試驗方法和OIE規(guī)定的國際標準N-based RT-PCR檢測技術,同時對這29份樣品進行檢測,并計算該試驗的相對敏感性與相對特異性。相對敏感性與相對特異性的計算方法如下:

2 結果

2.1 PCR擴增條件的優(yōu)化

為獲得該對引物最佳擴增效果和最高敏感性,對引物擴增的條件進行了摸索和調整,梯度性地改變變性溫度和時間,退火溫度和時間,延伸時間以及循環(huán)數(shù)等條件,最終確定了H1a/H2b的最佳擴增條件為50℃,30 min進行反轉錄;94℃,2 min;94℃1 min,60℃45 s,72℃1 min,30個循環(huán);最后72℃延伸7 min。

2.2 靈敏度試驗

用 RT-PCR方法擴增濃度為 77 ng/μ L的RNA模板和稀釋模板 1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000均出現(xiàn)明顯的目的條帶,即檢測到的目的基因的最低 RNA模板量為7.7×10-5ng/μ L(圖1)。

圖1 China/Tibet/07/PPRV RT-PCR敏感性試驗Fig.1 Sensitivity assay of China/Tibet/07/PPRV by RT-PCR

2.3 特異性試驗

對以上毒株進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳的結果表明,只有基因4系China/Tibet株,Turkey/2000株,Indian/Taylor/LN株的PCR產物在500 bp位置有一條與預計大小相符的條帶,而基因2系Nigeria75/1疫苗株,基因3系Sudan/sinar株,Oman/Dorccs株,RPV/RBOK株,RPV/Russian株,CDV及空白、陰性對照均無條帶(圖2)。

2.4 樣品檢測

臨床檢測結果表明,本試驗方法檢測為陽性的樣品,再用OIE國際規(guī)定的標準N-based RT-PCR方法檢測,也均為陽性。兩種方法的檢測結果完全一致。其中16頭羊為陽性,13頭羊為陰性,測得相對敏感性與相對特異性均為100%。

圖2 RT-PCR特異性擴增結果Fig.2 RT-PCR specific amplification results

3 討論

小反芻獸疫是一種發(fā)病率和死亡率很高的急性病毒病。雖然使用弱化毒株 Nigeria75/1進行免疫,可以使動物獲得3年以上的免疫力,但是該疫苗的廣泛應用,會嚴重干擾我國小反芻獸疫的血清學調查。疫苗研究的一個重要方面就是要建立能夠區(qū)分疫苗感染動物與自然感染動物的診斷方法。然而目前并沒有關于區(qū)分小反芻獸疫疫苗毒和野毒的檢測方法報道。采取RT-PCR方法對野毒和弱毒進行鑒別診斷報道已經很多,如臺灣的Shiow-Suey Lai等運用RT-PCR方法鑒別豬瘟野毒和三株豬瘟兔化弱毒苗[11],趙耘等[12-13]采用RT-PCR和酶切方法區(qū)分豬瘟疫苗毒與野毒,馬文軍等[14]運用 RTPCR方法區(qū)分偽狂犬野毒株和基因缺失苗等等一系列相關報道,為本研究提供了豐富的理論和技術背景。

小反芻獸疫的H基因全長為1 852 bp,ORF為1 827 bp,編碼609個氨基酸。H蛋白為糖蛋白,而且是麻疹病毒屬中最易變異的蛋白[9]。本研究就是利用H基因變異性大的特點,通過對基因2系Nigeria75/1弱毒疫苗,基因4系野毒株(China/Tibet/07分離株,Turkey/2000株,Indian/Taylor/LN株),基因 3系野毒株(Sudan/sinar株,Oman/Dorccs株),以及 RPV/RBOK株,RPV/Russian株,CDV的H基因進行分析,針對變異較為活躍的區(qū)域(位點為92 nt～113 nt,568 nt～547 nt),設計了擴增片段大小為477 bp的引物H1a/H2b。試驗結果證明該引物專一性強,不僅能夠準確的區(qū)分基因4系野毒株與基因2系Nigeria75/1弱毒株,而且不與基因3系毒株,RPV/RBOK株,RPV/Russian株,CDV發(fā)生交叉反應。該 RT-PCR方法可檢測到的最低模板量可達7.7×10-5ng/μ L,該值完全可以滿足作為診斷方法的要求。臨床應用中,用本試驗方法檢測的結果與OIE國際標準N-based RTPCR檢測法的結果完全一致。綜上所述,該試驗使用的引物,可以成功的擴增出國內流行的毒株,特異性好,靈敏度高,準確度高,因此有潛力用于獸醫(yī)臨床小反芻獸疫病毒的篩查和鑒別診斷。

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Establishment of RT-PCR Assay for Differentiation of Vaccine Strain and Wild-type Peste des Petits Ruminants Virus

ZHANG Ling1,2,BAO Jing-yue1,LI Lin1,WANG Zhi-liang1

(1.College of Animal Science and Technology,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong,266109,China;2.National Diagnostic Center for Exotic Animal Diseases,China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao,Shandong,266032,China)

Based on the H gene sequence of peste des petits ruminants virus(PPRV)published in GenBank,a pair of special primers were designed by Primer Premier 5.0,the fragment of amplification was 477 bp in length.The establishment of RT-PCR assay aimed to differentiate vaccine and field isolates of 4-type peste des petits ruminants virus.By using the one-step RT-PCR,the wild-type and vaccine strains of PPRV in clinical samples were detected and accurately distinguished.The detection limit concentration of RNA was 7.7×10-5ng/μ L.

RT-PCR;differentiation;Peste des petits ruminants virus(PPRV)

S852.659.5;S854.43

A

1007-5038(2010)03-0017-04

2009-10-13

農業(yè)部948項目(2006-G57(3))

張 玲(1984-),女,山東煙臺人,碩士,主要從事外來動物疫病檢測方法研究。*通訊作者